Ruolo dei microRNA specifici nella cefalea a grappolo (5*1000)

Background La cefalea a grappolo (CH) è una cefalea primaria inclusa nelle cefalalgie trigeminali autonomiche (TAC) secondo la Classificazione Internazionale del Disturbo della Cefalea, Terza Edizione. La CH è caratterizzata da una fisiopatologia sfaccettata e non completamente compresa. Si ritiene che l’ipotalamo, il complesso trigemino-vascolare e il riflesso trigemino-autonomo svolgano un ruolo significativo.

Prove sperimentali crescenti hanno evidenziato il coinvolgimento di specifici microRNA (miRNA) nel dolore cronico e nelle cefalee primarie, inclusa l’emicrania. I miRNA sono piccoli RNA endogeni non codificanti lunghi circa 22 nucleotidi. I miRNA funzionano come regolatori post-trascrizionali dell'espressione genica promuovendo la degradazione dell'RNA messaggero (mRNA) o reprimendo la traduzione dell'mRNA. Il processo di regolazione eseguito dai miRNA è complesso e articolato poiché un singolo miRNA potrebbe prendere di mira centinaia di mRNA diversi e, viceversa, ciascun mRNA può essere regolato da più miRNA. È stato stimato che più del 60% di tutti i geni codificanti proteine ​​sono regolati da miRNA che di conseguenza determinano la modulazione pleiotropica di un'ampia varietà di processi cellulari che coinvolgono differenziazione, sviluppo e segnalazione. I miRNA sono coinvolti nella generazione e nel mantenimento del dolore e diverse prove suggeriscono che specifici miRNA potrebbero svolgere un ruolo nell’emicrania.

In uno studio recente, abbiamo osservato una sovraregolazione dell'espressione genica in due miRNA, miR-382-5p e miR-34a-5p, nelle cellule mononucleari del sangue periferico (PBMC) in soggetti con emicrania cronica (CM). Questi miRNA sono coinvolti nella modulazione dell'infiammazione e nel rilascio di acido γ-aminobutirrico (GABA) rispetto agli individui con emicrania episodica e ai soggetti sani (HC). Questi risultati sottolineano una correlazione tra l’espressione genica di questi miRNA e il fenotipo dell’emicrania, nonché la sua gravità.

Studi recenti suggeriscono un ruolo attivo per alcuni neuropeptidi nel CH. Il gruppo danese ha infatti dimostrato che la somministrazione endovenosa di CGRP, PACAP o VIP può indurre attacchi acuti di CH in almeno il 50% dei partecipanti quando studiati nella fase attiva della malattia.

Al momento non ci sono dati riguardanti il ​​potenziale coinvolgimento dei miRNA nel CH. Questo studio mira a fornire un’esplorazione dettagliata del ruolo dei miRNA nella cefalea a grappolo, contribuendo alla nostra comprensione della fisiopatologia di questo disturbo primario della cefalea. Inoltre, i risultati ottenuti potrebbero aprire la strada allo sviluppo di una nuova generazione di molecole che potrebbero essere utilizzate nel campo della CH, come gli agonisti (Agomir) e gli antagonisti (Antagomir) dei miRNA.

Obiettivi L’obiettivo primario del nostro attuale progetto è quello di studiare l’espressione periferica dei miRNA implicati nella modulazione del dolore (miR-382-5p, miR-34a-5p e miR-155) in soggetti con CH episodica nella fase attiva (eCH- act), CH episodica in fase di remissione (eCH-rem), CH cronica (cCH) e soggetti sani di controllo (HC).

Metodi

Tutti i soggetti eseguiranno un'unica valutazione nel tempo durante la quale saranno sottoposti a:

• spiegazione delle procedure dello studio e firma del consenso informato
• visita di screening
• raccolta dati clinici e demografici (basata sulla revisione di un diario del mal di testa)
• prelievo di sangue venoso a digiuno
• somministrazione di questionari

Tutti i soggetti verranno valutati al mattino, dopo il digiuno notturno. Per i soggetti affetti da cCH o eCH-act, è previsto che il campionamento venga effettuato nella fase intercritica, definita dall'assenza di attacchi di CH per almeno 3 ore nei pazienti con eCH e per almeno 8 ore nei pazienti con cCH. Dopo il prelievo di sangue, i pazienti rimarranno al Centro per completare una serie di questionari. Ciò consentirà allo sperimentatore di monitorare i pazienti per almeno 2 ore, per escludere che venga eseguito un prelievo di sangue immediatamente prima di un attacco di CH.

Per i pazienti affetti da eCH, le fasi “attiva” e “remissione” saranno definite come segue:

• Fase attiva: la fase durante la quale gli attacchi di CH sono presenti da almeno 7 giorni.
• Fase di remissione: caratterizzata dall'assenza di attacchi di cefalea a grappolo per almeno 15 giorni consecutivi senza terapia farmacologica.

L'espressione dei geni miR-382-5p, miR-34a-5p e miRNA-155 sarà valutata nelle PBMC mediante trascrizione inversa in tempo reale (RT-PCR). Questa valutazione sarà normalizzata con U6 (un tipo di piccolo RNA nucleare utilizzato come gene housekeeping) ed espressa come quantificazione relativa (RQ). I livelli plasmatici di CGRP alfa, PACAP e VIP saranno misurati utilizzando kit ELISA commerciali validati. Una descrizione dettagliata dei metodi previsti per le analisi biochimiche può essere trovata qui: https://doi.org/10.1186/s10194-020-01189-0.

La serie di questionari clinici includerà: Valutazione della disabilità dell'emicrania (MIDAS), Test di impatto della cefalea (HIT-6), Questionario sull'impatto della cefalea a grappolo (CHIQ).

Calcolo della dimensione del campione e analisi statistica pre-pianificata Per il calcolo sono stati considerati i seguenti parametri: Dimensione dell'effetto: 0,5; errore alfa: 0,05; errore beta: 0,05 (potenza: 95%); numero di gruppi: 4.

Il calcolo della dimensione del campione è stato condotto utilizzando la piattaforma freeware G*Power (ver. 3.1.9.7) per un test ANOVA con correzione Bonferroni applicata ai 4 gruppi. La dimensione minima del campione suggerita è di 76 soggetti (19 soggetti per gruppo). Per tenere conto della potenziale variabilità, prevediamo di arruolare un totale di 100 soggetti, con 25 soggetti per gruppo.

Verranno utilizzate correlazioni parametriche e non parametriche per misurare la relazione tra variabili biochimiche e variabili cliniche. Le analisi multivariate verranno eseguite in base ai risultati dell'analisi univariata. La significatività statistica sarà fissata al livello del 5% (p<0,05).