Um estudo controlado randomizado nas redes integrando ansiedade e metabolismo na anorexia nervosa (NAMA)

Métodos

Projeto O estudo foi projetado como um ECR de um grupo único e de grupo paralelo com dois braços de estudo: (1) ingestão de caloria na refeição-1 e (2) sem ingestão de caloria na refeição-1. Os participantes e os controles saudáveis ​​são randomizados individualmente para um dos dois braços, ambos entregues na clínica de transtorno alimentar do Hospital Universitário EGE, Faculdade de Medicina.

A medida do desfecho primário são os padrões cerebrais observados com ressonância magnética e resultados secundários incluem marcadores endócrinos no sangue, respostas cardiovasculares, gravidade dos sintomas autorreferidos e subsequente consumo de alimentos.

O estudo é planejado de acordo com os itens de protocolo padrão: recomendações para ensaios intervencionistas (SPIRN) e serão analisados ​​e relatados de acordo com as recomendações em padrões consolidados de relatórios (consorte), com cuidados especiais tomados para atender às recomendações estendidas para ambos Ensaios com pacientes relataram resultados e ensaios não farmacológicos.

Projeto e conduta do protocolo para garantir a transparência e a integridade ao longo do estudo, todas as alterações ou desvios do protocolo serão minuciosamente documentados e relatados. Quaisquer modificações no protocolo, incluindo alterações nos objetivos do estudo, projeto, população participante, tamanho da amostra, procedimentos ou aspectos administrativos significativos, exigirão uma emenda formal de protocolo. Da mesma forma, quaisquer alterações que possam afetar potencialmente a segurança, os benefícios ou os riscos dos participantes serão cuidadosamente avaliados e documentados. As emendas propostas serão revisadas e aprovadas pela equipe de estudo e enviadas para aprovação ao Conselho Nacional de Revisão Ética antes da implementação. Além disso, todo o pessoal do estudo relevante será prontamente informado dessas mudanças para garantir a conformidade e a consistência em todo o estudo.

Recrutamento O estudo começará a recrutar participantes em fevereiro de 2025 e as últimas medições para o manuscrito primário devem ser coletadas até o final de 2026.

O recrutamento, as intervenções e a coleta de dados serão realizadas na Clínica de Transtorno Alimentar Especializado da Faculdade de Medicina do Hospital Universitário EGE em Izmir (População aproximadamente 4,5 milhões), Turquia. Antes dos participantes serem recrutados, garantiremos a implementação de boas diretrizes de prática clínica, o estabelecimento de uma infraestrutura de pesquisa clínica em funcionamento e o treinamento da estação de estudo.

Os participantes serão recrutados através de quatro caminhos possíveis: (1) Os pacientes serão recrutados no Hospital da Faculdade de Medicina da EGE da Universidade, por médicos que encontram esses pacientes. Controles saudáveis ​​serão recrutados por meio de (2) anúncios nos campi da EGE da Universidade, (3) hospitais locais e (4.) plataformas on -line como o Instagram.

Os indivíduos que concordam em participar serão contatados pelo pessoal do estudo para obter mais informações sobre o estudo por telefone. Naquela época, uma avaliação inicial para elegibilidade será realizada. Para mais avaliações de elegibilidade, consulte o próximo título. Para adolescentes que não podem ser contatados por telefone, os pais ou responsáveis ​​legais serão contatados. Os participantes potencialmente elegíveis serão agendados para um médico de estudo para avaliação adicional de elegibilidade e consentimento informado por escrito.

A elegibilidade do sexo feminino de 13 a 18 anos de idade, que atualmente são pacientes na clínica de transtorno alimentar e diagnosticados recém-diagnosticados com o Manual de Diagnóstico e Estatística dos Transtornos Mentais 5ª edição (DSM-5) e ingênuos será elegível. Os participantes do controle saudável serão comparados com o nível de idade, sexo e educação com os participantes da AN.

O diagnóstico/diagnóstico clínico para os participantes será validado/descartado pela entrevista clínica estruturada para o DSM-5 (SCID-5). Consulte "Medidas de linha de base para elegibilidade" para obter detalhes do instrumento. A presença de outros critérios de exclusão também será ainda mais explorada na visita clínica.

Os critérios de exclusão são: (1.) Ter uma ou várias condições médicas crônicas que podem interferir ou dificultar a participação ou afetar os resultados do estudo, (2.) Uso de medicamentos que afetam os níveis hormonais ou comportamentos alimentares, (3.) Tendo um ou vários distúrbios psiquiátricos graves que não sejam (por exemplo, esquizofrenia, transtorno depressivo maior, transtorno bipolar), (4.) O abuso de drogas atuais, a gravidez ou a potencial gravidez (para um paciente essas condições são excluídas como parte dos cuidados de rotina. Para controles saudáveis, nenhum teste objetivo será realizado), (5.) Alto risco de síndrome de referência ou complicações graves relacionadas a distúrbios alimentares, (6.) incapacidade de cumprir o programa nutricional do estudo (7.) Alergias aos alimentos Incluído no conteúdo da refeição fornecida, (8.) deficiências cognitivas que impedem a compreensão do estudo ou o processo de consentimento informado, (9.) Contra -indicações para a ressonância magnética (por exemplo, marcapasso, prótese, claustrofobia) e (10), açúcar no sangue em jejum acima 6,0 mmol/L na manhã do estudo, pois isso indica não conformidade com o jejum da noite para o dia ou pré-diabetes.

Critério de exclusão adicional para controles saudáveis: (1.) Tendo um ou vários distúrbios alimentares, atuais ou passados.

As descobertas inesperadas de anomalias bioquímicas em T0 (consulte "Avaliações" abaixo) não serão consideradas critérios de exclusão e as condições médicas serão encaminhadas para o tratamento apropriado.

A inclusão dos participantes no estudo será determinada por um clínico de estudo com base nos critérios de elegibilidade delineados. Nos casos de incerteza, o investigador principal tomará a decisão final. É importante ressaltar que, para manter a imparcialidade e evitar o viés seletivo de recrutamento, a inscrição médica será mascarada para futuras alocações de tratamento, pois a randomização ocorrerá posteriormente. Os participantes receberão informações orais e por escrito sobre o estudo e fornecerão consentimento informado por escrito antes da inclusão. Para participantes com menos de 18 anos de idade, o consentimento informado por escrito também será obtido de pais ou responsáveis ​​legais. A participação no estudo é voluntária e os participantes podem se retirar a qualquer momento sem consequências negativas ou atendimento subsequente afetado. Os participantes também podem optar por retirar quaisquer dados pessoais já coletados.

Randomização Quando um participante elegível foi recrutado e consentido, eles serão agendados para randomização posteriormente. Um participante será randomizado individualmente para um dos dois braços de estudo com uma taxa de alocação de 1: 1, por uma sequência de alocação gerada por computador usando blocos permutados. Os tamanhos dos blocos variam aleatoriamente entre dois e quatro.

As listas de randomização terão sido pré-preparadas por um pesquisador separado que não está envolvido no recrutamento de participantes. Os envelopes selados conterão o ID de estudo para cada participante e a refeição atribuída a esse indivíduo (calórica ou não calórica). Quando um participante estiver pronto para entrar no estudo, um pesquisador desenha um envelope e prepara a refeição designada para o participante da noite, para consumo na manhã seguinte.

Os participantes com um serão admitidos na unidade de hospital aberta da clínica na noite anterior à participação do estudo para garantir um jejum de 12 horas durante a noite. No dia seguinte, eles receberão as intervenções especificadas e passarão pelas avaliações descritas. Depois que um participante for randomizado e concluído o estudo, um participante de controle saudável correspondente será recrutado. O recrutamento de participantes do controle saudável será conduzido pelo pessoal do estudo, mascarado com os resultados da randomização do participante correspondente. Essa abordagem garante que a alocação de participantes de controle saudável e saudável permaneça oculta do recrutamento de pesquisadores e daqueles que conduzem avaliações. Os participantes do controle saudável passarão pelas mesmas avaliações de elegibilidade que os participantes, receberão seu próprio ID de estudo e compartilharão o mesmo resultado de randomização que o participante correspondente. No entanto, diferentemente dos participantes, os participantes do controle saudável não serão admitidos da noite para o dia.

Os códigos serão usados ​​para aumentar a confidencialidade das informações e o anonimato dos participantes, e a alocação dos participantes será realizada com base nesses códigos. A randomização continuará até n = 30 pacientes com AN e n = 30 controles saudáveis ​​concluíram o estudo como participantes por protocolo.

Os resultados da randomização não serão revelados a ninguém além do indivíduo que prepara a refeição atribuída. A etapa de randomização será, portanto, separada do processo de inscrição do paciente e de todos os outros processos do estudo. Através desses participantes, o pessoal do estudo e os médicos que entregam quaisquer co-intervenções serão mascarados à alocação dos participantes e, portanto, os avaliadores de resultados e analistas estatísticos.

O protocolo de intervenção, dependendo do resultado da randomização, os participantes serão solicitados a consumir uma das duas geleias, ambas compostas por um nutricionista e preparadas pelo pessoal do estudo: um contendo 400 quilocalorias e o outro livre de calorias. Os participantes e a pessoa que distribuem a geléia não terão conhecimento de seu conteúdo calórico. Os participantes receberão 15 minutos para consumir a geléia, sem forçá -los a fazê -lo, e a quantidade consumida será registrada.

Os alimentos calóricos usados ​​no estudo serão preparados com geléia em pó, água, açúcar em pó, canela, gengibre, açafrão e raspas de limão. Para fazer a mistura, 100 ml de água quente serão derramados sobre o pó de geléia lisa e agitados até ficarem totalmente dissolvidos. Oitenta gramas de açúcar em pó serão adicionados e agitados até serem completamente integrados. Para aprimoramento do sabor, 1 colher de chá de canela, gengibre e açafrão, juntamente com o entusiasmo de meio limão, será incorporado. Posteriormente, 100 ml de água fria serão adicionados e a mistura será agitada completamente. A mistura preparada será derramada em recipientes de serviço único, deixado esfriar à temperatura ambiente e depois refrigerado por 2-3 horas para solidificar.

A mistura sem calorias será feita com 200 ml de água, ágar-agar, adoçante natural, canela, gengibre, açafrão, raspas de limão e suco de limão. Esses ingredientes serão combinados e levados para ferver no fogão. Uma vez fervendo, a mistura será agitada continuamente por 5 minutos até começar a engrossar. O calor será desligado e a mistura esfriará por 15 minutos. Ele será transferido para recipientes e refrigerado por 3 horas para definir.

Os ingredientes e métodos de preparação foram cuidadosamente escolhidos para garantir que ambas as misturas tenham uma aparência e sabor semelhantes.

Três horas depois de consumir a primeira mistura (refeição-1), os participantes receberão uma segunda refeição (refeição-2). Esta refeição sempre conterá calorias e consistirá em um prato de aveia padrão nutricionalmente equilibrado com um sabor distinto desde a primeira refeição. Os participantes terão permissão para comer livremente, até um máximo de 500 kcal, para minimizar o risco de complicações médicas, como a síndrome de referência em participantes com um. Os participantes terão 45 minutos para concluir a refeição e o valor total consumido será registrado.

Além da refeição 1 e da refeição-2, qualquer ingestão oral, além da água, será proibida durante o tempo do estudo.

A adesão ao estudo Protocolo Protocolo A não adesão é definida como: (1.) Um participante retira seu consentimento, optando por interromper o estudo desde o momento da randomização até o final da coleta de dados T2, (2.) Descobriu-se que um participante recebeu o tipo errado de refeição na refeição-1, (3) Um participante consome ≤ 20 % dos alimentos fornecidos na refeição-1 (4.) Um participante come ou bebe qualquer coisa que não seja as refeições e a água fornecida entre a coleta de dados T0 e T2, (5.) Um participante se recusa ou não consegue passar por ressonância magnética em T2, (6.) Um participante não consegue aderir ao cronograma de estudo e (7.) Ocorre um evento adverso que torna inadequado a participação contínua, consulte "Eventos adversos e plano de segurança" abaixo para obter detalhes.

Todas as medidas de resultado detalhadas em "Avaliações" serão coletadas de todos os participantes. Para a análise primária, todos os dados dos participantes que aderem ao protocolo serão incluídos. Para detalhes, consulte a seção "Métodos Estatísticos" abaixo.

Eventos adversos e eventos adversos do plano de segurança (EAs) são definidos como quaisquer experiências indesejáveis ​​que requerem assistência médica que ocorram a um participante durante o estudo, independentemente de estarem relacionados ao estudo ou não. Todos os EAs relatados espontaneamente pelos participantes ou seus parentes, ou observados por investigadores, pessoal de estudo ou médicos, serão documentados no formulário de relato de caso eletrônico. Tanto o AES quanto os eventos adversos graves (SAEs) - incluindo aqueles que resultam em morte, com risco de vida, exigindo hospitalização ou envolvendo outras preocupações médicas significativas - serão prontamente relatadas ao investigador principal. Os SAEs avaliados como potencialmente relacionados ao estudo serão relatados ao Comitê de Ética Credenciado que aprovou o protocolo dentro de sete dias após o pesquisador responsável tomar conhecimento do evento.

Com base em estudos anteriores e dados preliminares não publicados, não é antecipada uma deterioração significativa dos sintomas durante o estudo. No entanto, para fins de segurança, os questionários de autorrelato coletados ao longo do estudo serão revisados ​​pelo pessoal do estudo. Espera-se que os pacientes fiquem ansiosos quando solicitados a comer uma refeição e as flutuações regulares dos sintomas relacionados à refeição não serão considerados eventos adversos. Qualquer outra piora observada dos sintomas ou reações adversas será abordada em discussões com o participante e, quando apropriado, seus pais ou responsáveis ​​legais.

Como as intervenções e avaliações são fornecidas como parte do sistema regular de saúde, todos os participantes são cobertos pelo seguro de lesão padrão do paciente. O monitoramento de estudo externo será realizado para garantir que todos os procedimentos de armazenamento, manuseio e análise de dados cumpram as diretrizes éticas, requisitos regulatórios, padrões de qualidade e protocolo.

As avaliações de escalas de autorrelato pré e pós-refeição serão administradas por meio de uma plataforma on-line segura acessível apenas à equipe de pesquisa. Os dados pseudonimizados dessas escalas, bem como de todas as outras avaliações, serão armazenados em um servidor seguro com backups regulares de segurança. As amostras biológicas coletadas durante o estudo serão codificadas e armazenadas em refrigeradores em um biobank certificado para a análise no sentido de emoção após a conclusão do conjunto de dados. Os registros físicos serão armazenados em armários trancados com acesso restrito. A chave de pseudonimização será armazenada com segurança em um local separado dos dados.

Os participantes despesas de viagem e alimentos, bem como os custos de bebidas, serão cobertos e isso equivale a aproximadamente 20 dólares americanos. Aqueles que não compareceram a compromissos agendados como parte do estudo serão lembrados por telefone ou e -mail. Os pais e/ou guardiões legais também podem ser contatados.

Medidas de elegibilidade Os registros médicos de todos os participantes serão analisados ​​para identificar comorbidades e outros critérios de exclusão. Os resultados bioquímicos que estarão disponíveis para pacientes com AN incluem perfil lipídico (níveis de colesterol total, HDL, LDL e triglicerídeos), nível de glicose no sangue, nível de insulina, TSH, T4, FSH, LH, estradiol, prolactina e PRC. Esses parâmetros são verificados rotineiramente em todos os pacientes com AN. Não serão realizados exames de sangue adicionais para identificar critérios de exclusão e, para controles saudáveis, esses exames de sangue não serão realizados.

As entrevistas do clínico serão realizadas para verificar o diagnóstico clínico em pacientes e descartar qualquer comorbidade em participantes e controle saudáveis. O SCID-5 será usado para complementar a entrevista clínica e será realizada por um psiquiatra bem treinado usado para aplicar o instrumento na prática. O SCID-5 é uma ferramenta confiável e válida para diagnosticar distúrbios psiquiátricos e suas propriedades psicométricas em turco são boas.

As avaliações para descrição do peso e altura do corpo da amostra serão medidas em T-1 para um cálculo do índice de massa corporal. Ao mesmo tempo, a formação sociodemográfica dos participantes será avaliada usando um breve questionário feito por si mesmo. Além disso, no T-1, as seguintes escalas de auto-classificação serão coletadas para fins de triagem e descrição da amostra: (1.) O Questionário de Triagem do Espectro do Autismo (ASSQ), (2.) O Inventário de Depressão das Crianças (CDI), (3.) A Escala de Triagem de Ansiedade da Infância (Çatö), (4.) O teste de atitudes alimentares (YTT) e (5. ) A Escala de Avaliação Global (GAS).

Medidas de resultado As medidas de resultado serão avaliadas nos pontos de tempo T0, T1, T2 e T3, com algumas medidas coletadas apenas em pontos de tempo específicos. Os detalhes sobre isso para cada medida de resultado são fornecidos sob seus respectivos subtítulos e resumidos na Tabela 1. Se um participante perder um ponto de tempo programado para coleta de dados, as etapas a seguir serão tomadas em sequência: (1) Se viável e significativo, os dados serão coletados assim que o problema for identificado; (2) se não, o ponto de dados pode ser registrado como faltando e o participante continuará no estudo; ou (3) se o participante for considerado não mais relevante para o estudo, será excluído de uma análise adicional de acompanhamento e por protocolo.

O auto-relato em avaliações psicométricas T0, T1, T2 e T3 serão realizadas em escalas visuais analógicas (VAS). As seguintes perguntas serão usadas nos pontos de tempo apropriados: (1.) Quão ansioso você está em consumir a refeição? Opções de resposta: Não sinto ansiedade - me sinto muito ansioso, (2.) Com que frequência você se sente ansioso por comer alimentos desconhecidos? Opções de resposta: Não me sinto ansioso - me sinto muito ansioso, (3.) Quão fome você se sente? Opções de resposta: me sinto cheio - sinto muito com fome. (4.) Você está preocupado com a possibilidade de ganhar peso ao consumir a refeição? Opções de resposta: não sinto ansiedade - me sinto muito ansioso, (5.) Quanto você teme se tornar obeso? Opções de resposta: Eu não temo - temo muito (6.). Quanto o pensamento de se tornar obeso afeta seus hábitos alimentares? Opções de resposta: não afeta - afeta muito (7.) Quão acima do peso você se sente? Opções de resposta: me sinto muito magro - me sinto muito acima do peso.

A amostragem de sangue nas amostras de sangue T0 e T2 será coletada de todos os participantes. No T0, a glicose em jejum dos participantes será medida. As medidas neuroendócrinas nas amostras de sangue coletadas em T0 incluirão grelina, obestatina, peptídeo YY (PYY), leptina e hormônios de cortisol. Essas análises serão realizadas usando kits disponíveis. Em T2, os mesmos parâmetros neuroendócrinos serão analisados ​​no sangue.

A pressão arterial e o pulso para avaliar as respostas cardiovasculares da pressão arterial e das medidas da frequência cardíaca serão realizadas usando um monitor de pressão arterial automática e um oxímetro de pulso (Sun Tech Medical, Oxfordshire, Inglaterra) em T0 e T2.

A ressonância magnética ressonância de ressonância magnética do estado de repouso será realizada em T0 e T2. Os exames de ressonância magnética serão realizados usando um scanner de ressonância magnética de 3,0 Tesla (Siemens Magnetom Verio, Numeis/4, Syngo MR B17, Erlangen, Alemanha) equipado com uma bobina de 12 canais. Primeiro, imagens estruturais serão obtidas com o toque 3D de espaço coronal axial de TSE e sequências 3D-MPRAGE. As imagens estruturais serão revisadas por um radiologista no local para identificar qualquer anomalias ou patologias cerebrais que tornariam um potencial participante inelegível (por exemplo, anormalidades estruturais, lesões). Se nenhum achado patológico for detectado, a imagem continuará com uma sequência de fMRI. Incluindo 9 minutos de fMRI em estado de repouso, onde os participantes manterão os olhos abertos e olham para uma cruz de fixação na tela.

O consumo de alimentos para refeições 1 e refeição-2, embora não seja estritamente considerado um resultado, a quantidade de mistura (em gramas) consumida na refeição-1 será registrada e incluída como variável de controle na análise. A quantidade de alimentos consumidos no Meal-2 também será registrada pesando o prato antes e depois da refeição.

Análise de Análise de Métodos Estatísticos será realizada assim que a coleta de dados estiver concluída. Nenhuma análise provisória será realizada. Inicialmente, a qualidade e a integridade dos dados serão avaliadas. Se disponível, os valores ausentes serão inseridos usando informações do arquivo de dados original do indivíduo. O conjunto de dados será examinado para valores discrepantes e inconsistências. Para variáveis ​​categóricas, quaisquer respostas fora das categorias definidas serão codificadas como faltando. Para variáveis ​​contínuas, os valores fora dos intervalos aceitáveis ​​também serão codificados como faltando.

As análises serão realizadas pelos investigadores e um bioestatístico usando a versão mais recente das estatísticas do SPSS (IBM Corp., Armonk, NY, EUA), R (R-Core Team, Viena, Áustria) ou software estatístico equivalente. Para a análise dos dados de fMRI, serão usadas ferramentas de software adicionais descritas abaixo. Os analistas de dados ficarão cegos para a alocação dos participantes. O teste de significância será bicaudal e as incertezas estatísticas serão relatadas como intervalos de confiança de 95%. Todos os testes serão realizados com um nível de significância de 0,05.

Estatísticas descritivas Os dados da linha de base e estatísticas descritivos serão relatados usando medidas padrão de acordo com as diretrizes de consorte e as características da linha de base dos participantes incluídas serão relatadas por grupo de randomização e um status em uma tabela de linha de base. As seguintes características da linha de base serão relatadas: idade (anos), uma comorbidade de subtipo (por categorias) (% sim, por categorias de diagnóstico), tabagismo (% sim, frequência), país de nascimento (% de peru,% de imigrante de primeira geração e% Imigrante de segunda geração-com pelo menos um pai nascido fora da Turquia). O sexo não será relatado, pois todos os participantes serão de sexo feminino.

Diagrama de fluxo do paciente O fluxo de participantes será ilustrado em um diagrama de fluxo de acordo com as recomendações da consorte.

Análise primária para a análise estatística de dados funcionais de neuroimagem, usaremos o software MATLAB e mapeamento paramétrico estatístico (SPM12) para avaliar os padrões e diferenças de atividade cerebral entre os grupos. A análise de conectividade será realizada usando a caixa de ferramentas Conn para examinar as relações entre diferentes regiões do cérebro e redes. Os dados de neuroimagem serão submetidos a pré -processamento para garantir que os dados sejam adequados para análises estatísticas adicionais.

As etapas de pré-processamento que serão executadas incluem, brevemente, (1.) Realinhamento: este é o processo de corrigir o movimento da cabeça dos participantes, (2.) Correção do tempo de fatia: isso envolve a correção de diferenças funcionais entre as fatias adquiridas a cada 3 segundos , (3) CORREGIRAÇÃO: Imagens anatômicas e funcionais são sobrepostas para determinar a localização anatômica da ativação, (4.) Normalização espacial: esse processo é responsável por formas individuais do cérebro, normalizando as imagens de ressonância magnética anatômica. O modelo desenvolvido pelo Montreal Neurological Institute (MNI) será usado e (5.) Smootamento: isso é usado para melhorar a qualidade da imagem e será realizado usando um kernel gaussiano 3D (FWHM = 8mm).

Após as etapas de pré-processamento, os dados de todos os participantes serão registrados no espaço comum do Atlas Cortical Harvard-Oxford. As análises de regressão no nível de participantes e no nível de grupo serão realizadas neste espaço do Atlas. As análises de conectividade funcional serão realizadas entre as regiões dos componentes da Rede de Saliência (SN), incluindo a ínsula anterior, o córtex cingulado anterior dorsal, a junção temporoparietal (TPJ) e o hipotálamo. Alterações na topologia das redes formadas por essas quatro regiões, além de sua conectividade funcional entre si, serão analisadas usando a teoria dos gráficos. As alterações nos recursos de conectividade dessas regiões antes e após a ingestão calórica/não calórica serão avaliadas usando métricas nodais e globais. Resultados significativos obtidos serão recalculados usando máscaras transferidas de volta para o espaço do participante. Os valores beta da análise de regressão serão controlados por erros do tipo 1 com taxa de descoberta falsa e relatados de acordo.

As variáveis ​​independentes das análises de regressão incluirão (1.) tipo de refeição (calórica ou não calórica), (2.) um status (um controle ou saudável), (3.) Um subtipo (tipo restritivo ou bulímico), (4.) Índice de massa corporal e (5.) duração de uma doença.

Análises secundárias As variáveis ​​de resultado secundário serão modeladas usando modelos de regressão semelhantes, conforme usado na análise primária. Nesses modelos, o tempo (T0/T1/T2) e a alocação por interação do tempo serão incluídos como efeitos fixos ao analisar variáveis ​​que são medidas em mais de dois pontos de tempo. Testes paramétricos adicionais serão realizados desde que as suposições sejam atendidas. Dependendo do tipo de dados, serão utilizados os seguintes métodos estatísticos: teste t independente, Pearson R e ANOVA. Quando necessário, alternativas não paramétricas correspondentes serão usadas.

As análises de resposta à dose-resposta serão realizadas por análises de dose-resposta, controlando os modelos de regressão especificados anteriormente para a quantidade de mistura consumida na refeição-1.

Cálculo do tamanho da amostra Um cálculo de potência foi realizado usando o software de energia G*para um teste t com regressão linear (dois grupos independentes), determinando que 27 participantes por grupo seriam suficientes. Para contabilizar possíveis abandonos ou questões imprevistas, 30 participantes serão recrutados para cada grupo para garantir uma análise estatística robusta.