Размер PPD и микобактерии туберкулеза ELISPOT у детей, получавших БЦЖ в неонатальном периоде

Выборка

1. Возраст до 3 лет: для выборки этой группы будет использована целевая группа из 500 детей. Эта когорта была впервые включена в исследование пероральной рота-вакцины с 2004 года. Они будут наблюдаться в когорте до 2006 года. В группу до 1 года будут зачислены 60 детей (1-2, 2-3 года, по 20 детей в каждой возрастной группе).
2. Возраст от 3 до 5 лет, кейсы будут набираться от волонтеров из детского сада (3-4, 4-5, 5-6 лет, по 20 детей в каждой возрастной группе)
3. Возраст от 6 до 15 лет, кейсы будут зачислены от учащихся-добровольцев начальной и средней школы (по 30 детей в каждой возрастной группе). Всего будет зачислено 300 детей от 6 до 15 лет.

3. Всего будет зачислено 460 детей в возрасте от 3 месяцев до 15 лет.

Процедура теста PPD Детям, отвечающим критериям, внутрикожно вводят 0,1 мл PPD (PPD RT23, 2 единицы) в соответствии с рекомендациями ВОЗ (17). Туберкулин для анализов получают из Дании и используют по всей стране. Индурации PPD будут считываться через 48-72 часа после введения под углом 90 градусов от самой длинной оси плеча и записываться с точностью до миллиметра. Уплотнения <=5 мм в диаметре классифицируются как отрицательные, >5, но <=10 мм - как сомнительные, а >10 мм - как положительные в соответствии с предыдущим консенсусом (2). Все размеры уплотнений будут записаны для дальнейшего анализа, кроме произвольной классификации.

Процедура анализа ELISPOT для выявления Т-клеток, специфичных к антигенам M.tuberculosis 4 мл цельной крови сначала собирают в гепаринизированную пробирку, а затем обрабатывают и оценивают два ученых, не имевших доступа к личным идентификаторам или результатам ТКП в течение четырех часов после сбора. Мы амплифицировали ген esat-6 из геномной ДНК, выделенной из штамма M bovis AN5 с помощью ПЦР, и клонировали его в плазмидный вектор pET21d (Novagen, Мэдисон, Висконсин, США). Escherichia coli трансформировали этим вектором. Рекомбинантный ESAT-6 выделяли из трансформированной кишечной палочки и очищали с помощью аффинной хроматографии на никеле. Мы провели анализ интерферона-гамма ELISPOT ex-vivo с 300 000 мононуклеарных клеток периферической крови на лунку (14,18). Мы использовали очищенные рекомбинантные ESAT-6 и PPD в дополнение к отрицательному контролю (без добавления антигена) и положительному контролю (фитогемагглютинин). Положительные тестовые лунки ESAT-6 определялись как содержащие по меньшей мере на десять пятнистых клеток больше, чем лунки с отрицательным контролем, и по крайней мере в два раза больше, чем лунки с отрицательным контролем — порог обнаружения один на 30 000 мононуклеарных клеток периферической крови. Анализы были проведены и независимо оценены двумя учеными, которые не знали о категории воздействия и результатах ТКП контактов. Лунки для анализа ELISPOT, содержащие более 300 пятнистообразующих клеток, невозможно точно подсчитать, поскольку пятна сливаются. Поэтому 300 клеток на лунку (эквивалентно 1000 клеток на миллион мононуклеарных клеток периферической крови) было принято за верхний предел точности (15).

Исключение и последующие шаги Дети, у которых обнаружен положительный результат теста PPD (> 10 мм), размер PPD находится в диапазоне 1-го 2,5 процентиля или у которых положительный результат ELISPOT на момент зачисления, будут находиться под пристальным наблюдением для будут проведены клинические симптомы и признаки туберкулеза и необходимые диагностические исследования. При наличии серьезных подозрений на ЛТБИ будет начата профилактика. Родственникам и лицам, осуществляющим уход, будет предложено пройти рентгенографию для исключения активного легочного ТБ.

Сбор информации при зачислении Будет проведено поперечное исследование 160 детей. Дети были осмотрены и оценены по общему состоянию здоровья, истории вакцинации БЦЖ и рубцу БЦЖ на левой руке (19). Возможный контакт с ТБ, в том числе пожилые люди с хроническим кашлем или необъяснимым длительным лихорадочным заболеванием при домашнем контакте, любой анамнез контактов с задокументированным открытым ТБ будет тщательно оценен. Дети с подозрением на иммунодефицит, активным заболеванием легких или наличием туберкулеза в анамнезе будут исключены, и будет проведено последующее наблюдение.

Биостатистический метод Описательный анализ будет использоваться для определения размера PPD и результатов ELISPOT. Значение P рассчитывается с помощью критерия Стьюдента, критерия Хи-квадрат или точного критерия Фишера для статистической значимости (версия 10.0, SPSS, SPSS Inc., Иллинойс) между различными возрастными группами. 95% ДИ будет рассчитываться в качестве порогового значения размера PPD (за исключением пациентов с неожиданно обнаруженным заболеванием ТБ).