Studie av avkommor till kvinnor med typ 1-diabetes (EPICOM)

Introduktion

Hälsoförhållanden beror på en kombination av genetisk mottaglighet och miljöpåverkan. Medan genotypen bestäms vid befruktningen moduleras och påverkas fenotypen av miljömässiga och epigenetiska faktorer under hela livet, inte bara postnatalt utan redan i livmodern och möjligen även vid preimplantationsstadier.

Nyligen genomförda studier har belyst den möjliga rollen av intrauterin exponering för maternell diabetes i patogenesen av övervikt, typ 2-diabetes och kardiovaskulär sjukdom. En hyperglykemisk intrauterin miljö kan också påverka kognitiv funktion, barndomstillväxt och pubertetsutveckling hos avkomman. Under 1993-99 rapporterades alla graviditeter hos kvinnor med pre-gestationell typ 1-diabetes prospektivt till ett nationellt register i det danska diabetesförbundet. Detta rikstäckande register innehåller detaljerad information om moderns demografi, graviditetsresultat och diabetesstatus inklusive glykerat hemoglobin (HbA1c) i en potentiell kohort av 900 kvinnor och deras nyfödda avkomma. Dessa data är därför idealiska för en storskalig studie om långtidseffekter av en diabetisk intrauterin miljö.

Studien består av 3 delstudier.

Mål

Studie I

Att studera långtidseffekter av en diabetisk intrauterin miljö hos avkommor till kvinnor med typ 1-diabetes jämfört med matchade kontroller från bakgrundspopulationen med avseende på:

A)

• Kognitiv funktion
• Pubertal utveckling
• Diabetes/pre-diabetes
• Övervikt

B) Att studera om HbA1c-nivå under graviditet är en oberoende prediktor för dessa utfall inom studiegruppen.

Studie II

Att studera skillnader i avkomma till kvinnor med typ 1-diabetes jämfört med avkomma från bakgrundspopulationen med avseende på:

• sjuklighet och medfödda missbildningar
• medicinsk vård
• dödlighet

Studie III

Att studera skillnader i avkomma till kvinnor med typ 1-diabetes jämfört med jämförelse med matchade kontroller från bakgrundspopulationen utan familjehistoria av diabetes med avseende på:

A) State-of-the-art metabolisk karakterisering med euglykemisk-hyperinsulinemisk klämma

B) DNA-metylering, RNA-transkription och proteinkvantifiering i muskler och fettvävnad

Design

Studien är en prospektiv uppföljningsstudie. I studiegruppen ingår avkommor till kvinnor med typ 1-diabetes från det nationella födelseregistret för diabetes (1993-99, n=900) med information om HbA1c före befruktning och/eller 1:a trimestern HbA1c och en kontrollgrupp med avkommor till kvinnor utan diabetes som levererat under samma period matchade med avseende på kön och ålder på avkomma och familjens postnummer som en indirekt markör för den socioekonomiska bakgrunden.

Material och metoder

Kliniska egenskaper vid exponeringstillfället:

Studiegrupp (diabetesexponerade):

Följande data rapporterades till det nationella födelseregistret för diabetes:

Mödrar:

• Demografi (ålder, paritet, längd, vikt före graviditeten)
• Diabetesstatus (pregestationell /1:a trimestern HbA1c, 3:e trimestern HbA1c, pre-gestationell /1:a trimestern Urinalbuminutsöndring, hypertoni, proliferativ retinopati, diabetesvaraktighet, pregestationell insulinbehov (IE/d), förekomst av allvarliga hypoglykemiska händelser)
• Graviditetskomplikationer (Preeklampsi, för tidig förlossning)

Avkomma:

• Demografi (gestationsålder, födelsevikt)
• Neonatal sjuklighet (medfödda missbildningar, hypoglykemi, respiratory distress syndrome, gulsot, systemisk infektion)

Kontrollgrupp Moderns ålder, paritet, längd, pre-gestational vikt, information om havandeskapsförgiftning, graviditetsålder, födelsevikt och neonatal sjuklighet kommer att samlas in från journaler.

Examinationsprogram vid uppföljning:

Studie I: Klinisk studie (450 diabetesexponerade och 450 kontroller i åldern 13-19 år) Klinisk undersökning för att fastställa effekten av intrauterin hyperglykemi på tillväxt, pubertetsutveckling, metabolism och kognitiv funktion i barndomen.

Examina

Deltagarna träffas fastande på morgonen. Följande undersökningar kommer att utföras:

Diabetes/prediabetes:

• Oralt glukostoleranstest (OGTT) med glukos, insulin, C-peptid och proinsulin vid 0, 30, 120 minuter
• Blodtryck
• HbA1c, cytokiner (CRP, Interleukin-6), adiponektin, leptin, inkretiner
• GAD-antikroppar
• Blodprov för DNA-analys

Fetma:

• Body mass index (BMI), midje-/höftomkrets
• Lipider (totalt, HDL-C, LDL-C, triglycerider)
• Dubbelenergiröntgenabsorptiometri (DEXA) skanning för att bestämma kroppssammansättning

Tillväxt och pubertetsutveckling:

• Längd, sitthöjd, vikt, huvudomkrets
• Pubertalstadiet (bröstutveckling/testikelstorlek och könshår)
• Hirsutism hos flickor?
• Insulinliknande tillväxtfaktor-1 (IGF-1), fri EGF-1, insulinliknande tillväxtfaktorbindande protein 3 (IGFBP-3), insulinliknande tillväxtfaktorbindande protein 1 (IGFBP-1)
• Testosteron, östradiol, könshormonbindande globulin (SHBG), follikelstimulerande hormon (FSH), luteiniserande hormon (LH), inhibin A, inhibin B, anti-mülleriskt hormon (AMH)
• Adrenala androgener: dehydroepiandrosteronsulfat (DHEA-S) och Δ4 androgen androstenedion (ADION)
• Sköldkörtelhormoner: sköldkörtelstimulerande hormon (TSH), tyroxin (T4), fritt tyroxin (fT4)

Kognitiv undersökning inklusive:

• Bedömning av global intelligens: Reynolds Intellectual Assessment Scales (RIAS)
• Bedömning av specifika kognitiva funktioner Attention Learning and Memory Psykomotorisk hastighet och reaktionstid

Barnen och deras föräldrar kommer att bli ombedda att fylla i ett frågeformulär som tar upp psykosociala aspekter, demografi (längd, vikt) och historia av menstruationscykeln. Dessutom kommer barnen att ombes fylla i ett frågeformulär om Självrapporterad fysisk aktivitet (IPAQ-enkät).

Primära slutpunkter

• Kognitiv funktion
• Pubertal utveckling
• Diabetes/pre-diabetes
• Övervikt (> 85-percentil för ålder och kön)

Sekundära slutpunkter

• BMI
• Kroppssammansättning (% kroppsfett)
• Blodtryck
• Dyslipidemi
• Insulinnivåer
• Markörer för endotelfunktion
• Markörer för autoimmunitet (GAD-antikroppar)
• Polycystiskt ovariesyndrom (PCOS)

Studie II: Registerbaserad studie (n=900 diabetesexponerade; för varje fall kommer vi att matcha kön och ålder 100 kontroller, vilket resulterar i n=90 000 kontroller i åldern 12-18 år) En registerbaserad studie kommer att utföras för att fastställa effekt av intrauterin hyperglykemi på medfödda missbildningar, sjuklighet och mortalitet i barndomen.

Studiepopulation I kohorten på 900 barn från den nationella diabetesfödelsekohorten kommer vi att studera alla ämnen med hjälp av registerdata om sjuklighet, dödlighet och användning av receptbelagd medicin. För varje diabetesexponerad person kommer Danmarks Statistik att identifiera 100 ålders-, köns- och kalendertidsmatchade kontroller från bakgrundspopulationen från Central Personregister (Danmarks Statistik).

Sjuklighet och dödlighet - Verksamhetsstrategi

1. I det nationella patientregistret (NRP) och det nationella cancerregistret kommer alla diagnoser från identifierade diabetesexponerade och kontroller att identifieras.
2. I National Drug Prescription Database kommer all information om receptbelagda läkemedel om identifierade diabetesexponerade och kontroller att identifieras.
3. I det nationella dödsregistret kommer alla diagnoser från identifierade diabetesexponerade och kontroller att identifieras.

Ändpunkter Sjuklighet: diabetesexponerade vs. kontroller från bakgrundspopulationen Medicinsk behandling: diabetesexponerade vs. kontroller från bakgrundspopulationen. Dödlighet: diabetesexponerade vs. kontroller från bakgrundspopulationen

Statistik Incidensrater kommer att beräknas som nya fall per 100 000 per år och analyseras med Poisson-regression. Via Danmarks Statistik kommer kontroller att identifieras och matchas på lämpligt sätt.

Morbiditet och mortalitet kommer att analyseras av Kaplan-Meier-statistiken, med log-rank test och Cox-regression med relevanta kovariater.

Studie III: Delstudie (n=50 diabetesexponerade och n=50 oexponerade kontroller i åldern 18-19 år) Avkomma till mödrar med typ 1-diabetes, födda före 1 januari 1994 (över 18 år vid datumet för inbjudan), och vem som deltog i studie A kommer att bjudas in att delta i studie B. Studie B förväntas involvera cirka 50 diabetesexponerade och cirka 50 oexponerade kontroller i åldern 18-19 år vid undersökningstillfället. Studiegrupperna kommer att matchas efter BMI, kön, födelsedatum och nivå av fysisk aktivitet. Alla deltagare bör vara drognaiva och friska med ett BMI mellan 20 och 30, och kontroller bör inte ha någon familjehistoria av diabetes. Eftersom alla deltagare kommer att vara över 18 år kommer de att kunna ge informerat skriftligt samtycke.

Exklusions kriterier:

1. Okänd sjukdom eller behov av medicinering som uppstår efter inkludering,
2. Onormalt EKG, screening av blodprover och/eller svår hypertoni, och
3. Nedsatt glukostolerans hos icke-diabetiker.

Den utvalda undergruppen av avkommor till mödrar med typ 1-diabetes och matchade kontroller kommer att undersökas genom state-of-the-art metabolisk karakterisering med användning av euglykemisk-hyperinsulinemisk klämma med spårglukos i kombination med indirekt kalorimetri som möjliggör tillförlitliga uppskattningar av glukosavfallshastigheter i hela kroppen, endogen glukosproduktion och glukos- och lipidoxidation. Dessutom kommer bedömning av fysisk aktivitetsnivå med hjälp av IPAQ-enkäten att kompletteras med studier av maximal syreförbrukning (VO2max). Under klämstudierna gjordes vävnadsbiopsier från subkutant bukfett och lårmuskel (m. vastus lateralis) kommer att erhållas för studier av potentiella långsiktiga molekylära konsekvenser av intrauterin exponering för hyperglykemi - metaboliskt minne från födseln. Detta kommer att innefatta tillämpning av flera upptäcktslägen (hypotesfria), globala tillvägagångssätt som transkriptionell profilering med mikroarraybaserad teknologi, kvantitativ proteomik, bioinformatik inklusive väganalys och efterföljande validering av observerade abnormiteter med qRT-PCR, immunoblotting och annat mer klassiskt protein tekniker.

Examina:

Fysisk aktivitet (dag 1)

Barnen och deras föräldrar kommer att ombes fylla i ett frågeformulär som tar upp psykosociala och demografiska aspekter och självrapporterad fysisk aktivitet (IPAQ-enkät). VO2-max bestäms av ett graderat maximalt test (VO2-topp) på en cykelergometer med indirekt kalorimetri.

Den senaste metaboliska karakteriseringen (dag 2):

Euglykemisk-hyperinsulinemisk klämma Patienter läggs in efter 12 timmars fasta över natten till centrum på Odense Universitetssjukhus. De instrueras att konsumera en standardiserad kost och att avstå från fysisk aktivitet i 48 timmar innan experimenten. Försökspersonerna undersöks med en euglykemisk-hyperinsulinemisk klämma (insulin 40mU/min/m2 under 4 timmar) med användning av spårteknik enligt beskrivning55. Studierna kombineras med indirekt kalorimetri som möjliggör uppskattningar av glukosavfallshastigheter, endogen glukosproduktion, glukos- och lipidoxidation och icke-oxidativ glukosmetabolism enligt beskrivning. Blodprover tas var 20:e minut under klämman för bedömning av plasmaglukos, FFA, adipokiner och seruminsulin och C-peptid. Under de basala och insulinstimulerade tillstånden tas vävnadsbiopsier från m. vastus lateralis och subkutant bukfett med en modifierad Bergström-nål med sug under lokalbedövning. Varje biopsi fryses snabbt i flytande kväve inom 30 s och förvaras vid -130°C för senare analys enligt beskrivningen nedan. Kroppsfett (%) bestäms av bioimpedansmetoden.

Transkriptomik och proteomisk analys av skelettmuskulatur och fettvävnad inkluderar:

Mikroarray-baserad transkriptionsprofilering och biologisk väganalys:

Upptäcktsläge kvantitativ proteomik av vävnadsbiopsier:

Målinriktad kvantitativ proteomik:

Kvantitativ RT-PCR

Immunblotting

Genetisk analys:

Analys av DNA-metylering

Helgenomets metyleringsanalys

Metyleringskänslig högupplöst smältanalys (MS-HRM)

Analys av genuttryck

Sekvensering

Statistisk analys Mann-Whitney U-test kommer att användas för att bedöma för varje CpG om två grupper hade samma fördelning av metylering. För att eliminera sonder som inte fungerade och andra divergerande värden kommer betavärdena i varje grupp att trimmas för extremer innan beräkningen av det genomsnittliga betavärdet. Därefter kommer endast gener med den högsta 5% svansen av de absoluta genomsnittliga betavärdesskillnaderna mellan de två grupperna att väljas. Således kommer CpG med ett p-värde under 0,005 och med de högsta betavärdesskillnaderna mellan de två grupperna att användas för identifiering av gener med statistiskt signifikanta diabetesspecifika förändringar i metylering. Jämförelse av array-metyleringsresultat med MS-HRM-resultat kommer att utföras med ett Mann-Whitney U-test och ett Chi2-test för trend. Spearman-koefficienter kommer att beräknas för att bedöma korrelationen mellan metylering och genuttryck.

Nyhet och betydelse

Den snabbt ökande bördan av övervikt och hjärt- och kärlsjukdomar håller på att bli ett hot mot både den individuella och globala ekonomin. Det är därför viktigt att identifiera riskgrupper för att inrikta sig på förebyggande strategier. Exponering för intrauterin hyperglykemi bidrar till epidemin genom en ond cirkel som för den ökade känsligheten vidare till nästa generation via vägar som bara är sparsamt förstådda.

Denna studie inkluderar en mycket stor kohort av diabetesexponerade avkommor av välkarakteriserade prospektivt studerade kvinnor med typ 1-diabetes. Den innehåller information om moderns glykemi under graviditeten, vilket är absolut nödvändigt för att bedöma möjliga samband med uppskattningar av avkommans metabolism och kognitiv funktion. Den registerbaserade studien är unik och möjliggör insamling av information om sjuklighet och dödlighet i hela kohorten. Den specifika molekylära signaturen för intrauterin exponering för hyperglykemi i mänskliga vävnader har såvitt vi vet inte undersökts tidigare, och även om de ovan nämnda studierna tyder på möjlig involvering av vissa vägar i skelettmuskulatur och fettvävnad, är det viktigt att undersöka det metabola minnet av födseln genom att använda hypotesfria globala tillvägagångssätt i upptäcktsläge för att upptäcka potentiella störningar i både förväntade och oväntade vägar.