Untersuchung der Nachkommen von Frauen mit Typ-1-Diabetes (EPICOM)

Einführung

Gesundheitszustände resultieren aus einer Kombination von genetischer Anfälligkeit und Umwelteinflüssen. Während der Genotyp bei der Empfängnis bestimmt wird, wird der Phänotyp während des gesamten Lebens durch Umwelt- und epigenetische Faktoren moduliert und beeinflusst, nicht nur postnatal, sondern bereits in der Gebärmutter und möglicherweise sogar in Präimplantationsstadien.

Jüngste Studien haben die mögliche Rolle der intrauterinen Exposition gegenüber mütterlichem Diabetes bei der Pathogenese von Übergewicht, Typ-2-Diabetes und Herz-Kreislauf-Erkrankungen hervorgehoben. Eine hyperglykämische intrauterine Umgebung kann auch die kognitive Funktion, das kindliche Wachstum und die pubertäre Entwicklung der Nachkommen beeinträchtigen. Zwischen 1993 und 1999 wurden alle Schwangerschaften von Frauen mit Typ-1-Diabetes vor der Schwangerschaft prospektiv einem nationalen Register der Dänischen Diabetesvereinigung gemeldet. Dieses landesweite Register enthält detaillierte Informationen zur mütterlichen Demographie, zum Schwangerschaftsausgang und zum Diabetesstatus einschließlich glykiertem Hämoglobin (HbA1c) in einer prospektiven Kohorte von 900 Frauen und ihren neugeborenen Nachkommen. Diese Daten sind daher ideal für eine großangelegte Studie zu Langzeiteffekten eines diabetischen intrauterinen Milieus.

Die Studie besteht aus 3 Teilstudien.

Ziele

Studie I

Es sollten die Langzeitwirkungen einer diabetischen intrauterinen Umgebung bei Nachkommen von Frauen mit Typ-1-Diabetes im Vergleich zu passenden Kontrollen aus der Hintergrundpopulation in Bezug auf Folgendes untersucht werden:

A)

• Kognitive Funktion
• Pubertätsentwicklung
• Diabetes/Prädiabetes
• Übergewicht

B) Untersuchung, ob der HbA1c-Spiegel in der Schwangerschaft ein unabhängiger Prädiktor für diese Ergebnisse innerhalb der Studiengruppe ist.

Studie II

Untersuchung von Unterschieden bei Nachkommen von Frauen mit Typ-1-Diabetes im Vergleich zu Nachkommen aus der Hintergrundpopulation in Bezug auf:

• Morbidität und angeborene Fehlbildungen
• medizinische Behandlung
• Mortalität

Studie III

Untersuchung der Unterschiede bei den Nachkommen von Frauen mit Typ-1-Diabetes im Vergleich zu gematchten Kontrollen aus der Hintergrundpopulation ohne familiäre Vorgeschichte von Diabetes in Bezug auf:

A) Modernste metabolische Charakterisierung mittels euglykämisch-hyperinsulinämischer Klemme

B) DNA-Methylierung, RNA-Transkription und Proteinquantifizierung in Muskel- und Fettgewebe

Design

Die Studie ist eine prospektive Folgestudie. Die Studiengruppe umfasst die Nachkommen von Frauen mit Typ-1-Diabetes aus dem nationalen Diabetes-Geburtsregister (1993-99, n=900) mit Angaben zu HbA1c vor der Empfängnis und/oder HbA1c im 1. Trimester sowie eine Kontrollgruppe mit Nachkommen von Frauen ohne Diabetes die im selben Zeitraum entbunden haben, stimmen hinsichtlich Geschlecht und Alter der Nachkommen sowie der Postleitzahl der Familie als indirekter Marker für den sozioökonomischen Hintergrund überein.

Material und Methoden

Klinische Merkmale zum Zeitpunkt der Exposition:

Studiengruppe (Diabetes-exponiert):

Folgende Daten wurden an das nationale Diabetes-Geburtenregister gemeldet:

Mütter:

• Demographie (Alter, Parität, Größe, Gewicht vor der Schwangerschaft)
• Diabetesstatus (HbA1c vor der Schwangerschaft/1. Trimenon, HbA1c im 3. Trimenon, Albuminausscheidungsrate im Urin vor der Schwangerschaft/1. Trimenon, Bluthochdruck, proliferative Retinopathie, Diabetesdauer, Insulinbedarf vor der Schwangerschaft (IE/d), Auftreten schwerer hypoglykämischer Ereignisse)
• Schwangerschaftskomplikationen (Präeklampsie, Frühgeburt)

Nachwuchs:

• Demographie (Gestationsalter, Geburtsgewicht)
• Neonatale Morbidität (angeborene Fehlbildungen, Hypoglykämie, Atemnotsyndrom, Gelbsucht, systemische Infektion)

Kontrollgruppe Mütterliches Alter, Parität, Größe, Gewicht vor der Schwangerschaft, Informationen über Präeklampsie, Gestationsalter, Geburtsgewicht und neonatale Morbidität werden aus den Krankenakten erhoben.

Untersuchungsprogramm im Follow-up:

Studie I: Klinische Studie (450 Diabetes-exponierte und 450 Kontrollpersonen im Alter von 13-19 Jahren) Klinische Untersuchung zur Bestimmung der Wirkung einer intrauterinen Hyperglykämie auf Wachstum, Pubertätsentwicklung, Stoffwechsel und kognitive Funktionen im Kindesalter.

Prüfungen

Die Teilnehmer treffen sich morgens nüchtern. Folgende Prüfungen werden durchgeführt:

Diabetes/Prädiabetes:

• Oraler Glukosetoleranztest (OGTT) mit Glukose, Insulin, C-Peptid und Proinsulin bei 0, 30, 120 Minuten
• Blutdruck
• HbA1c, Zytokine (CRP, Interleukin-6), Adiponektin, Leptin, Inkretine
• GAD-Antikörper
• Blutprobe für die DNA-Analyse

Fettleibigkeit:

• Body-Mass-Index (BMI), Taillen-/Hüftumfang
• Lipide (gesamt, HDL-C, LDL-C, Triglyceride)
• Dual-Energy-Röntgen-Absorptiometrie (DEXA)-Scan zur Bestimmung der Körperzusammensetzung

Wachstum und pubertäre Entwicklung:

• Körpergröße, Sitzhöhe, Gewicht, Kopfumfang
• Pubertätsstadium (Brustentwicklung/Hodengröße und Schambehaarung)
• Hirsutismus bei Mädchen?
• Insulin-like Growth Factor-1 (IGF-1), freies EGF-1, Insulin-like Growth Factor-binding protein 3 (IGFBP-3), Insulin-like Growth Factor-binding protein 1 (IGFBP-1)
• Testosteron, Estradiol, Sexualhormon-bindendes Globulin (SHBG), Follikel-stimulierendes Hormon (FSH), Luteinisierendes Hormon (LH), Inhibin A, Inhibin B, Anti-Müller-Hormon (AMH)
• Nebennieren-Androgene: Dehydroepiandrosteronsulfat (DHEA-S) und Δ4-Androgen-Androstendion (ADION)
• Schilddrüsenhormone: Schilddrüsen-stimulierendes Hormon (TSH), Thyroxin (T4), freies Thyroxin (fT4)

Kognitive Untersuchung einschließlich:

• Bewertung der globalen Intelligenz: Reynolds Intellectual Assessment Scales (RIAS)
• Bewertung spezifischer kognitiver Funktionen Aufmerksamkeitslernen und Gedächtnis Psychomotorische Geschwindigkeit und Reaktionszeit

Die Kinder und ihre Eltern werden gebeten, einen Fragebogen zu psychosozialen Aspekten, demografischen Daten (Größe, Gewicht) und der Vorgeschichte des Menstruationszyklus auszufüllen. Darüber hinaus werden die Kinder gebeten, einen Fragebogen zur selbstberichteten körperlichen Aktivität (IPAQ-Fragebogen) auszufüllen.

Primäre Endpunkte

• Kognitive Funktion
• Pubertätsentwicklung
• Diabetes/Prädiabetes
• Übergewicht (> 85. Perzentil für Alter und Geschlecht)

Sekundäre Endpunkte

• BMI
• Körperzusammensetzung (% Körperfett)
• Blutdruck
• Dyslipidämie
• Insulinspiegel
• Marker der Endothelfunktion
• Marker der Autoimmunität (GAD-Antikörper)
• Polyzystisches Ovarialsyndrom (PCOS)

Studie II: Registerbasierte Studie (n = 900 Diabetes-exponierte Personen; für jeden Fall gleichen wir Geschlecht und Alter mit 100 Kontrollen ab, was zu n = 90.000 Kontrollen im Alter von 12-18 Jahren führt) Eine registerbasierte Studie wird durchgeführt, um die zu bestimmen Wirkung der intrauterinen Hyperglykämie auf angeborene Fehlbildungen, Morbidität und Mortalität im Kindesalter.

Studienpopulation In der Kohorte von 900 Kindern aus der nationalen Diabetes-Geburtskohorte werden wir alle Probanden anhand von Registerdaten zu Morbidität, Mortalität und Verwendung verschreibungspflichtiger Medikamente untersuchen. Für jede Diabetes-exponierte Person wird Statistics Denmark 100 nach Alter, Geschlecht und Kalenderzeit abgeglichene Kontrollen aus der Hintergrundpopulation aus dem zentralen Personenregister (Statistics Denmark) identifizieren.

Morbidität und Mortalität - Operative Strategie

1. Im Nationalen Patientenregister (NRP) und im Nationalen Krebsregister werden alle Diagnosen von identifizierten Diabetes-Exponierten und Kontrollpersonen erfasst.
2. In der National Drug Prescription Database werden alle Informationen zu verschreibungspflichtigen Medikamenten bei identifizierten Diabetes-Exponierten und Kontrollpersonen erfasst.
3. Im National Registry of Death werden alle Diagnosen von identifizierten Diabetes-exponierten und Kontrollpersonen identifiziert.

Endpunkte Morbidität: Diabetes-exponiert vs. Kontrollen aus der Hintergrundpopulation Medizinische Behandlung: Diabetes-exponiert vs. Kontrollen aus der Hintergrundpopulation Mortalität: Diabetes-exponiert vs. Kontrollen aus der Hintergrundpopulation

Statistik Inzidenzraten werden als neue Fälle pro 100.000 pro Jahr berechnet und mit der Poisson-Regression analysiert. Über Statistics Denmark werden die Kontrollen identifiziert und entsprechend abgeglichen.

Morbidität und Mortalität werden anhand der Kaplan-Meier-Statistik mit Log-Rank-Test und Cox-Regression mit relevanten Kovariaten analysiert.

Studie III: Teilstudie (n=50 Diabetes-exponierte und n=50 nicht-exponierte Kontrollen im Alter von 18–19 Jahren) Nachkommen von Müttern mit Typ-1-Diabetes, geboren vor dem 1 Einladung), und die an Studie A teilgenommen haben, werden zur Teilnahme an Studie B eingeladen. An Studie B werden voraussichtlich etwa 50 Diabetes-exponierte und etwa 50 nicht-exponierte Kontrollpersonen im Alter von 18 bis 19 Jahren zum Zeitpunkt der Untersuchung teilnehmen. Die Studiengruppen werden nach BMI, Geschlecht, Geburtsdatum und körperlicher Aktivität gematcht. Alle Teilnehmer sollten arzneimittelnaiv und gesund mit einem BMI zwischen 20 und 30 sein, und die Kontrollgruppe sollte keine familiäre Vorgeschichte von Diabetes haben. Da alle Teilnehmer über 18 Jahre alt sein werden, können sie eine informierte schriftliche Einwilligung erteilen.

Ausschlusskriterien:

1. Jede unbekannte Krankheit oder Medikamentenbedarf, die nach der Aufnahme auftritt,
2. Abnormales EKG, Screening-Bluttests und/oder schwerer Bluthochdruck und
3. Beeinträchtigte Glukosetoleranz bei Nicht-Diabetikern.

Die ausgewählte Untergruppe von Nachkommen von Müttern mit Typ-1-Diabetes und passenden Kontrollen wird durch modernste metabolische Charakterisierung unter Verwendung von euglykämisch-hyperinsulinämischer Klemme mit Tracer-Glukose in Kombination mit indirekter Kalorimetrie untersucht, die zuverlässige Schätzungen der Ganzkörper-Glukoseabbauraten ermöglicht, endogene Glukoseproduktion und Glukose- und Lipidoxidation. Darüber hinaus wird die Erfassung des körperlichen Aktivitätsniveaus mit dem IPAQ-Fragebogen durch Studien zum maximalen Sauerstoffverbrauch (VO2max) ergänzt. Bei den Clamp-Studien werden Gewebebiopsien aus subkutanem Bauchfett und Oberschenkelmuskel (m. vastus lateralis) werden für Studien über mögliche langfristige molekulare Folgen einer intrauterinen Exposition gegenüber Hyperglykämie - metabolisches Gedächtnis der Geburt - erhalten. Dies umfasst die Anwendung mehrerer (hypothesenfreier) Entdeckungsmodi, globaler Ansätze wie Transkriptionsprofilierung mit Microarray-basierten Technologien, quantitative Proteomik, Bioinformatik einschließlich Pathway-Analyse und anschließende Validierung beobachteter Anomalien mit qRT-PCR, Immunblotting und anderen klassischeren Proteinen Technologien.

Prüfungen:

Körperliche Aktivität (Tag 1)

Die Kinder und ihre Eltern werden gebeten, einen Fragebogen zu psychosozialen und demografischen Aspekten sowie zur selbstberichteten körperlichen Aktivität (IPAQ-Fragebogen) auszufüllen. VO2-max wird durch einen abgestuften Maximaltest (VO2-peak) auf einem Fahrradergometer mittels indirekter Kalorimetrie bestimmt.

Modernste metabolische Charakterisierung (Tag 2):

Euglykämisch-hyperinsulinämische Klemme Die Probanden werden nach 12-stündigem Fasten über Nacht in das Zentrum des Universitätskrankenhauses Odense eingeliefert. Sie werden angewiesen, eine standardisierte Ernährung zu sich zu nehmen und vor den Experimenten 48 Stunden lang auf körperliche Aktivität zu verzichten. Die Studienteilnehmer werden mit einer euglykämisch-hyperinsulinämischen Klemme (Insulin 40 mU/min/m2 für 4 h) unter Verwendung der Tracer-Technologie wie beschrieben55 untersucht. Die Studien werden mit indirekter Kalorimetrie kombiniert, was Schätzungen der Glukoseabbauraten, der endogenen Glukoseproduktion, der Glukose- und Lipidoxidation und des nicht-oxidativen Glukosestoffwechsels, wie beschrieben, ermöglicht. Blutproben werden alle 20 Minuten während der Klemme zur Bestimmung von Plasmaglukose, FFA, Adipokinen und Seruminsulin und C-Peptid entnommen. Während der basalen und insulinstimulierten Zustände werden Gewebebiopsien von m. Vastus lateralis und subkutanes Bauchfett mit einer modifizierten Bergström-Nadel mit Absaugung unter örtlicher Betäubung. Jede Biopsie wird innerhalb von 30 s schnell in flüssigem Stickstoff eingefroren und zur späteren Analyse wie unten beschrieben bei -130 °C gelagert. Körperfett (%) wird durch die Bioimpedanzmethode bestimmt.

Die Transkriptomik- und Proteomanalyse von Skelettmuskeln und Fettgewebe umfasst:

Microarray-basierte Transkriptionsprofilierung und Analyse des biologischen Signalwegs:

Quantitative Proteomik von Gewebebiopsien im Entdeckungsmodus:

Gezielte quantitative Proteomik:

Quantitative RT-PCR

Immunoblot

Genetische Analyse:

Analyse der DNA-Methylierung

Analyse der gesamten Genommethylierung

Methylierungssensitive hochauflösende Schmelzanalyse (MS-HRM)

Genexpressionsanalyse

Sequenzierung

Statistische Analyse Der Mann-Whitney-U-Test wird verwendet, um für jedes CpG zu beurteilen, ob zwei Gruppen die gleiche Methylierungsverteilung aufwiesen. Um nicht funktionierende Sonden und andere abweichende Werte zu eliminieren, werden die Beta-Werte in jeder Gruppe vor der Berechnung des durchschnittlichen Beta-Werts auf Extreme getrimmt. Als nächstes werden nur Gene mit den höchsten 5%-Schwanz der absoluten durchschnittlichen Beta-Wert-Unterschiede zwischen den beiden Gruppen ausgewählt. Daher werden CpGs mit einem p-Wert unter 0,005 und mit den höchsten Beta-Wert-Unterschieden zwischen den beiden Gruppen zur Identifizierung von Genen mit statistisch signifikanten diabetesspezifischen Methylierungsveränderungen verwendet. Der Vergleich der Array-Methylierungsergebnisse mit den MS-HRM-Ergebnissen wird mit einem Mann-Whitney-U-Test und einem Chi2-Trendtest durchgeführt. Spearman-Koeffizienten werden berechnet, um die Korrelation zwischen Methylierung und Genexpression zu beurteilen.

Neuheit und Bedeutung

Die schnell zunehmende Belastung durch Übergewicht und Herz-Kreislauf-Erkrankungen wird sowohl für den Einzelnen als auch für die Weltwirtschaft zu einer Bedrohung. Daher ist es wichtig, Risikogruppen zu identifizieren, um präventive Strategien zu entwickeln. Die Exposition gegenüber intrauteriner Hyperglykämie trägt zur Epidemie durch einen Teufelskreis bei, der die erhöhte Anfälligkeit über Wege, die nur spärlich verstanden werden, an die nächste Generation weitergibt.

Diese Studie umfasst eine sehr große Kohorte von Diabetes-exponierten Nachkommen von gut charakterisierten, prospektiv untersuchten Frauen mit Typ-1-Diabetes. Es enthält Informationen zur mütterlichen Glykämie während der Schwangerschaft, die unbedingt erforderlich sind, um mögliche Zusammenhänge mit Schätzungen des Stoffwechsels und der kognitiven Funktion der Nachkommen zu bewerten. Die registerbasierte Studie ist einzigartig und ermöglicht die Erhebung von Informationen zu Morbidität und Mortalität in der gesamten Kohorte. Die spezifische molekulare Signatur der intrauterinen Exposition gegenüber Hyperglykämie in menschlichen Geweben wurde unseres Wissens noch nicht untersucht, und obwohl die oben genannten Studien die mögliche Beteiligung bestimmter Signalwege im Skelettmuskel und im Fettgewebe nahelegen, ist es wichtig, das metabolische Gedächtnis zu untersuchen der Geburt unter Verwendung hypothesenfreier globaler Ansätze im Entdeckungsmodus, um potenzielle Störungen sowohl in erwarteten als auch in unerwarteten Pfaden zu entdecken.