1型糖尿病の女性の子孫に関する研究 (EPICOM)

序章

健康状態は、遺伝的感受性と環境の影響の組み合わせによって生じます。 遺伝子型は受胎時に決定されますが、表現型は、出生後だけでなく、すでに子宮内にあり、場合によっては着床前の段階でさえ、生涯を通じて環境およびエピジェネティックな要因によって調節および影響を受けます。

最近の研究では、過体重、2 型糖尿病、心血管疾患の病因における母体の糖尿病への子宮内曝露の役割の可能性が強調されています。 高血糖の子宮内環境は、子孫の認知機能、小児期の成長および思春期の発達にも影響を与える可能性があります。 1993 年から 1999 年の間に、妊娠前の 1 型糖尿病の女性のすべての妊娠が、デンマーク糖尿病協会の全国登録簿に前向きに報告されました。 この全国規模のレジストリには、900 人の女性とその新生児の将来コホートにおける、母親の人口統計、妊娠の結果、糖化ヘモグロビン (HbA1c) を含む糖尿病の状態に関する詳細な情報が含まれています。 したがって、これらのデータは、糖尿病の子宮内環境の長期的な影響に関する大規模な研究に理想的です。

この研究は 3 つのサブ研究で構成されています。

目的

勉強Ⅰ

1型糖尿病の女性の子孫における糖尿病の子宮内環境の長期的な影響を、背景集団からのマッチした対照と比較して研究すること:

A)

• 認知機能
• 思春期の発達
• 糖尿病/前糖尿病
• 太りすぎ

B) 妊娠中の HbA1c レベルが研究グループ内でこれらの転帰の独立した予測因子であるかどうかを研究すること。

研究Ⅱ

1 型糖尿病の女性の子孫と、背景集団の子孫との違いを調べるには、次の点について検討します。

• 罹患率および先天性奇形
• 医療
• 死亡

研究Ⅲ

1型糖尿病の女性の子孫の違いを、糖尿病の家族歴のないバックグラウンド集団からのマッチした対照と比較して研究するには:

A) 正常血糖-高インスリンクランプを使用した最先端の代謝特性評価

B) 筋肉および脂肪組織における DNA メチル化、RNA 転写およびタンパク質定量化

デザイン

この研究は前向き追跡研究です。 研究グループには、受胎前のHbA1cおよび/または第1トリメスターHbA1cの情報を持つ全国糖尿病出生登録簿（1993-99、n = 900）からの1型糖尿病の女性の子孫と、糖尿病のない女性の子孫を含む対照グループが含まれます同じ期間に誰が出産したかは、社会経済的背景の間接的なマーカーとして、子孫の性別と年齢、および家族の郵便番号に関して一致しました。

材料と方法

暴露時の臨床的特徴:

研究グループ（糖尿病暴露）：

以下のデータは、全国糖尿病出生登録簿に報告されました。

母親の：

• 人口統計（年齢、産卵数、身長、妊娠前体重）
• 糖尿病の状態 (妊娠前/第 1 トリメスター HbA1c、第 3 トリメスター HbA1c、妊娠前/第 1 トリメスターの尿中アルブミン排泄率、高血圧、増殖性網膜症、糖尿病期間、妊娠前インスリン必要量 (IE/d)、重度の低血糖イベントの発生)
• 妊娠合併症（子癇前症、早産）

子孫：

• 人口統計（妊娠期間、出生時体重）
• 新生児罹患率（先天奇形、低血糖、呼吸窮迫症候群、黄疸、全身感染症）

対照群 母体の年齢、出産歴、身長、妊娠前体重、子癇前症に関する情報、妊娠期間、出生時体重および新生児罹患率を医療記録から収集する。

フォローアップ時の検査プログラム:

研究 I: 臨床研究 (13 ～ 19 歳の 450 人の糖尿病患者と 450 人の対照者) 小児期の成長、思春期の発達、代謝、認知機能に対する子宮内高血糖の影響を調べるための臨床検査。

検査

参加者は朝に断食します。 以下の検査が行われます。

糖尿病/前糖尿病:

• 0、30、120分でのグルコース、インスリン、C-ペプチド、およびプロインスリンによる経口ブドウ糖負荷試験（OGTT）
• 血圧
• HbA1c、サイトカイン（CRP、インターロイキン-6）、アディポネクチン、レプチン、インクレチン
• GAD抗体
• DNA分析用の血液サンプル

肥満：

• 体格指数（BMI）、ウエスト/ヒップ周囲
• 脂質（総、HDL-C、LDL-C、トリグリセリド）
• 体組成を決定するための二重エネルギー X 線吸収測定法 (DEXA) スキャン

成長と思春期の発達:

• 身長、座高、体重、頭囲
• 思春期（乳房の発育・睾丸の大きさ・陰毛）
• 女の子の多毛症？
• インスリン様成長因子-1 (IGF-1)、遊離 EGF-1、インスリン様成長因子結合タンパク質 3 (IGFBP-3)、インスリン様成長因子結合タンパク質 1 (IGFBP-1)
• テストステロン、エストラジオール、性ホルモン結合グロブリン（SHBG）、卵胞刺激ホルモン（FSH）、黄体形成ホルモン（LH）、インヒビンA、インヒビンB、抗ミュラー管ホルモン（AMH）
• 副腎アンドロゲン: 硫酸デヒドロエピアンドロステロン (DHEA-S)、および Δ4 アンドロゲン アンドロステンジオン (ADION)
• 甲状腺ホルモン：甲状腺刺激ホルモン（TSH）、サイロキシン（T4）、遊離チロキシン（fT4）

以下を含む認知検査：

• グローバルインテリジェンスの評価: Reynolds Intellectual Assessment Scales (RIAS)
• 特定の認知機能の評価 注意 学習と記憶 精神運動速度と反応時間

子供とその両親は、心理社会的側面、人口統計（身長、体重）、および月経周期の歴史に対処するアンケートに記入するよう求められます. さらに、子供たちは自己申告による身体活動に関するアンケート (IPAQ アンケート) に記入するよう求められます。

一次エンドポイント

• 認知機能
• 思春期の発達
• 糖尿病/前糖尿病
• 太りすぎ（年齢と性別の85パーセンタイル以上）

二次エンドポイント

• BMI
• 体組成（体脂肪率）
• 血圧
• 脂質異常症
• インスリンレベル
• 内皮機能のマーカー
• 自己免疫のマーカー (GAD 抗体)
• 多嚢胞性卵巣症候群 (PCOS)

研究 II: レジスターベースの研究 (n=900 糖尿病にさらされた; すべてのケースで性別と年齢を一致させ、100 人のコントロールを作成し、n=90,000 のコントロールが 12-18 歳になる)小児期の先天性奇形、罹患率および死亡率に対する子宮内高血糖の影響。

研究集団 全国の糖尿病出生コホートからの 900 人の子供のコホートで、罹患率、死亡率、および処方薬の使用に関する登録データを利用して、すべての被験者を研究します。 デンマーク統計局は、糖尿病にさらされたすべての人について、Central Person Register (デンマーク統計局) のバックグラウンド集団から、年齢、性別、および暦時間が一致する 100 人の対照を特定します。

罹患率と死亡率 - 運用戦略

1. National Registry of Patient (NRP) および National Cancer Registry では、特定された糖尿病曝露者および対照者からのすべての診断が特定されます。
2. National Drug Prescription Database では、特定された糖尿病曝露およびコントロールに関する処方薬に関するすべての情報が特定されます。
3. National Registry of Death では、特定された糖尿病曝露者および対照者からのすべての診断が特定されます。

エンドポイント 罹患率: 糖尿病曝露群 vs. バックグラウンド集団からのコントロール 治療: 糖尿病曝露群 vs. バックグラウンド集団からのコントロール 死亡率: 糖尿病曝露群 vs. バックグラウンド集団からのコントロール

統計 発生率は、年間 100.000 件あたりの新規症例として計算され、ポアソン回帰によって分析されます。 統計デンマークのコントロールを介して識別され、適切に照合されます。

罹患率と死亡率は、ログランク検定と関連する共変量を使用した Cox 回帰を使用して、Kaplan-Meier 統計によって分析されます。

研究 III: サブ研究 (n=50 の糖尿病曝露者および n=50 の非曝露対照群、18 ～ 19 歳) 1994 年 1 月 1 日より前に生まれた 1 型糖尿病の母親の子孫研究 A に参加した人は、研究 B に参加するように招待されます。研究 B には、検査時の年齢が 18 ～ 19 歳の約 50 人の糖尿病曝露者と約 50 人の非曝露対照者が参加すると予想されます。 研究グループは、BMI、性別、生年月日、および身体活動のレベルに従って一致します。 すべての参加者は、BMI が 20 から 30 の間で、薬剤未使用で健康でなければならず、コントロールには糖尿病の家族歴があってはなりません。 すべての参加者は 18 歳以上であるため、書面によるインフォームド コンセントを提供することができます。

除外基準:

1. 包含後に発生する未知の疾患または投薬の必要性、
2. 異常な心電図、スクリーニング血液検査および/または重度の高血圧、および
3. 非糖尿病患者における耐糖能障害。

1 型糖尿病の母親と対応するコントロールを持つ母親の子孫の選択されたサブグループは、トレーサー グルコースと間接熱量測定を組み合わせた正常血糖-高インスリン血症クランプを使用した最先端の代謝特性評価によって調査され、全身のグルコース処理率の信頼できる推定が可能になります。内因性グルコース産生およびグルコースと脂質の酸化。 さらに、IPAQ アンケートを使用した身体活動レベルの評価は、最大酸素消費量 (VO2max) の研究によって補完されます。 クランプ研究中に、皮下腹部脂肪および大腿筋からの組織生検 (m. 外側広筋）は、高血糖への子宮内曝露の潜在的な長期の分子的影響の研究のために取得されます-出生の代謝記憶。 これには、マイクロアレイベースの技術を使用した転写プロファイリング、定量的プロテオミクス、経路分析を含むバイオインフォマティクス、qRT-PCR、イムノブロッティング、その他のより古典的なタンパク質を使用した観察された異常のその後の検証など、いくつかの発見モード (仮説のない) のグローバルなアプローチの適用が含まれます。技術。

検査:

身体活動（1日目）

子供とその両親は、心理社会的および人口統計学的側面と自己報告された身体活動 (IPAQ アンケート) に対処するアンケートに記入するよう求められます。 VO2-max は、間接熱量測定を使用したサイクル エルゴメーターでの段階的最大テスト (VO2-peak) によって決定されます。

最先端の代謝特性評価 (2 日目):

正常血糖-高インスリンクランプ 12時間一晩絶食させた後、対象をオーデンセ大学病院のセンターに入院させる。 彼らは、標準化された食事を消費し、実験の 48 時間前に身体活動を控えるように指示されています。 研究対象は、記載されているようにトレーサー技術を使用して、正常血糖-高インスリンクランプ (インスリン 40mU/分/m2 で 4 時間) によって検査されます 55。 研究は間接熱量測定と組み合わされ、記載されているように、グルコース処理速度、内因性グルコース産生、グルコースと脂質の酸化、および非酸化的グルコース代謝の推定を可能にします。 血液サンプルは、血漿グルコース、FFA、アディポカイン、および血清インスリンと C-ペプチドの評価のために、クランプ中に 20 分ごとに採取されます。 基礎およびインスリン刺激状態の間、mから組織生検が採取されます。局所麻酔下で吸引を伴う変更された Bergstrom 針を使用して、外側広筋および皮下腹部脂肪。 各生検材料は液体窒素で 30 秒以内に急速凍結され、後述の分析のために -130 °C で保存されます。 体脂肪率（％）は、生体インピーダンス法により測定されます。

骨格筋および脂肪組織のトランスクリプトミクスおよびプロテオーム解析には、以下が含まれます。

マイクロアレイベースの転写プロファイリングと生物学的経路分析:

組織生検の発見モードの定量的プロテオミクス:

ターゲットを絞った定量的プロテオミクス:

定量的RT-PCR

イムノブロッティング

遺伝子解析:

DNAメチル化の解析

全ゲノムメチル化解析

メチル化に敏感な高分解能融解分析 (MS-HRM)

遺伝子発現解析

シーケンシング

統計分析 Mann-Whitney U 検定を使用して、各 CpG について、2 つのグループのメチル化分布が同じかどうかを評価します。 機能しなかったプローブやその他の異なる値を排除するために、平均ベータ値を計算する前に、各グループのベータ値が極端にトリミングされます。 次に、2 つのグループ間の絶対平均ベータ値差の 5% テールが最も高い遺伝子のみが選択されます。 したがって、0.005 未満の p 値を持ち、2 つのグループ間でベータ値の差が最も大きい CpG を使用して、メチル化に統計的に有意な糖尿病特異的変化がある遺伝子を特定します。 配列のメチル化結果と MS-HRM の結果との比較は、マンホイットニーの U 検定とトレンドの Chi2 検定を使用して実行されます。 スピアマン係数を計算して、メチル化と遺伝子発現の相関を評価します。

新規性と重要性

過体重と心血管疾患の負担が急速に増加し、個人経済と世界経済の両方に対する脅威になりつつあります。 したがって、予防戦略を対象とするリスクグループを特定することが不可欠です。 子宮内高血糖への曝露は、まばらにしか理解されていない経路を介して次世代に感受性の増加を伝える悪循環を通じて流行に寄与します。

この研究には、1 型糖尿病の十分に特徴付けられた前向きに研究された女性の糖尿病にさらされた子孫の非常に大規模なコホートが含まれています。 これには、妊娠中の母親の血糖に関する情報が含まれており、子孫の代謝と認知機能の推定値との関連性を評価するために不可欠です。 登録ベースの研究はユニークであり、コホート全体の罹患率と死亡率に関する情報の収集を可能にします。 ヒト組織における高血糖への子宮内曝露の特定の分子的特徴は、私たちの知る限り、これまで調査されていませんでした。上記の研究は、骨格筋および脂肪組織における特定の経路の関与の可能性を示唆していますが、代謝記憶を調査することが重要です。予想される経路と予期しない経路の両方で潜在的な摂動を発見するために、仮説のない発見モードのグローバルなアプローチを使用して出生の研究を行います。