Studie av avkom til kvinner med type 1-diabetes (EPICOM)

Introduksjon

Helsetilstander skyldes en kombinasjon av genetisk følsomhet og miljøpåvirkning. Mens genotypen bestemmes ved unnfangelse, moduleres og påvirkes fenotypen av miljømessige og epigenetiske faktorer gjennom hele livet, ikke bare postnatalt, men allerede i livmoren og muligens til og med ved preimplantasjonsstadier.

Nyere studier har fremhevet den mulige rollen av intrauterin eksponering for maternell diabetes i patogenesen av overvekt, type 2 diabetes og kardiovaskulær sykdom. Et hyperglykemisk intrauterint miljø kan også påvirke kognitiv funksjon, barndomsvekst og pubertetsutvikling hos avkommet. I løpet av 1993-99 ble alle graviditeter hos kvinner med pre-gestasjonell type 1 diabetes prospektivt rapportert til et nasjonalt register i den danske diabetesforeningen. Dette landsomfattende registeret inneholder detaljert informasjon om mødredemografi, graviditetsutfall og diabetesstatus inkludert glykert hemoglobin (HbA1c) i en potensiell kohort på 900 kvinner og deres nyfødte avkom. Disse dataene er derfor ideelle for en storstilt studie om langtidseffekter av et diabetisk intrauterint miljø.

Studiet består av 3 delstudier.

Mål

Studie I

For å studere langtidseffekter av et diabetisk intrauterint miljø hos avkom av kvinner med type 1 diabetes sammenlignet med matchede kontroller fra bakgrunnsbefolkningen med hensyn til:

EN)

• Kognitiv funksjon
• Pubertal utvikling
• Diabetes/pre-diabetes
• Overvektig

B) For å studere om HbA1c-nivå i svangerskapet er en uavhengig prediktor for disse utfallene i studiegruppen.

Studie II

For å studere forskjeller i avkom til kvinner med type 1 diabetes sammenlignet med avkom fra bakgrunnsbefolkningen med hensyn til:

• sykelighet og medfødte misdannelser
• medisinsk behandling
• dødelighet

Studie III

For å studere forskjeller i avkom til kvinner med type 1 diabetes sammenlignet med sammenlignet med matchede kontroller fra bakgrunnsbefolkningen uten familiehistorie med diabetes med hensyn til:

A) State-of-the-art metabolsk karakterisering ved bruk av euglykemisk-hyperinsulinemisk klemme

B) DNA-metylering, RNA-transkripsjon og proteinkvantifisering i muskler og fettvev

Design

Studien er en prospektiv oppfølgingsstudie. Studiegruppen inkluderer avkom av kvinner med type 1 diabetes fra det nasjonale fødselsregisteret for diabetes (1993-99, n=900) med informasjon om HbA1c før unnfangelse og/eller 1. trimester HbA1c og en kontrollgruppe som inkluderer avkom av kvinner uten diabetes som leverte i samme periode samsvarte med hensyn til kjønn og alder på avkom og familiens postnummer som en indirekte markør for sosioøkonomisk bakgrunn.

Materialer og metoder

Kliniske egenskaper ved eksponeringstidspunktet:

Studiegruppe (diabeteseksponert):

Følgende data ble rapportert til det nasjonale fødselsregisteret for diabetes:

Mødre:

• Demografi (alder, paritet, høyde, vekt før svangerskapet)
• Diabetesstatus (pregestasjonell /1. trimester HbA1c, 3. trimester HbA1c, pre-gestasjonell /1. trimester Urin Albumin utskillelseshastighet, hypertensjon, proliferativ retinopati, diabetesvarighet, pregestasjonelt insulinbehov (IE/d), forekomst av alvorlige hypoglykemiske hendelser)
• Graviditetskomplikasjoner (preeklampsi, prematur fødsel)

Avkom:

• Demografi (gestasjonsalder, fødselsvekt)
• Neonatal morbiditet (medfødte misdannelser, hypoglykemi, respiratorisk distress syndrome, gulsott, systemisk infeksjon)

Kontrollgruppe Mors alder, paritet, høyde, pre-gestasjonell vekt, informasjon om svangerskapsforgiftning, svangerskapsalder, fødselsvekt og neonatal sykelighet vil bli samlet inn fra journaler.

Eksamensprogram ved oppfølging:

Studie I: Klinisk studie (450 diabeteseksponerte og 450 kontroller i alderen 13-19 år) Klinisk undersøkelse for å bestemme effekten av intrauterin hyperglykemi på vekst, pubertetsutvikling, metabolisme og kognitiv funksjon i barndommen.

Eksamener

Deltakerne møter fastende om morgenen. Følgende undersøkelser vil bli utført:

Diabetes/prediabetes:

• Oral glukosetoleransetest (OGTT) med glukose, insulin, C-peptid og proinsulin ved 0, 30, 120 minutter
• Blodtrykk
• HbA1c, cytokiner (CRP, Interleukin-6), adiponectin, leptin, inkretiner
• GAD-antistoffer
• Blodprøve for DNA-analyse

Fedme:

• Kroppsmasseindeks (BMI), midje/hofteomkrets
• Lipider (totalt, HDL-C, LDL-C, triglyserider)
• Dual energy X-ray absorptiometri (DEXA) skanning for å bestemme kroppssammensetning

Vekst og pubertetsutvikling:

• Høyde, sittehøyde, vekt, hodeomkrets
• Pubertalstadiet (brystutvikling/testikkelstørrelse og kjønnshår)
• Hirsutisme hos jenter?
• Insulinlignende vekstfaktor-1 (IGF-1), fri EGF-1, insulinlignende vekstfaktorbindende protein 3 (IGFBP-3), insulinlignende vekstfaktorbindende protein 1 (IGFBP-1)
• Testosteron, østradiol, kjønnshormonbindende globulin (SHBG), follikkelstimulerende hormon (FSH), luteiniserende hormon (LH), inhibin A, inhibin B, anti-mullersk hormon (AMH)
• Adrenale androgener: dehydroepiandrosteronsulfat (DHEA-S) og Δ4 androgen androstenedion (ADION)
• Skjoldbruskhormoner: Skjoldbruskstimulerende hormon (TSH), tyroksin (T4), fritt tyroksin (fT4)

Kognitiv undersøkelse inkludert:

• Vurdering av global intelligens: Reynolds Intellectual Assessment Scales (RIAS)
• Vurdering av spesifikke kognitive funksjoner Oppmerksomhet Læring og hukommelse Psykomotorisk hastighet og reaksjonstid

Barna og deres foreldre vil bli bedt om å fylle ut et spørreskjema som tar for seg psykososiale aspekter, demografi (høyde, vekt) og historie om menstruasjonssyklusen. Videre vil barna bli bedt om å fylle ut et spørreskjema om Egenrapportert fysisk aktivitet (IPAQ-spørreskjema).

Primære endepunkter

• Kognitiv funksjon
• Pubertal utvikling
• Diabetes/pre-diabetes
• Overvekt (> 85-persentil for alder og kjønn)

Sekundære endepunkter

• BMI
• Kroppssammensetning (% kroppsfett)
• Blodtrykk
• Dyslipidemi
• Insulinnivåer
• Markører for endotelfunksjon
• Markører for autoimmunitet (GAD-antistoffer)
• Polycystisk ovariesyndrom (PCOS)

Studie II: Registerbasert studie (n=900 diabeteseksponerte; for hvert tilfelle vil vi matche 100 kontroller med kjønn og alder, noe som resulterer i n=90 000 kontroller i alderen 12-18 år) En registerbasert studie vil bli utført for å fastslå effekt av intrauterin hyperglykemi på medfødte misdannelser, sykelighet og dødelighet i barndommen.

Studiepopulasjon I kohorten på 900 barn fra det nasjonale fødselskohorten diabetes vil vi studere alle emner ved bruk av registerdata om sykelighet, dødelighet og bruk av reseptbelagte medisiner. For hver diabeteseksponert person vil Danmarks Statistik identifisere 100 alders-, kjønns- og kalendertidsmatchede kontroller fra bakgrunnspopulasjonen fra Det Centrale Personregister (Danmarks Statistik).

Sykelighet og dødelighet - Operasjonell strategi

1. I Nasjonalt pasientregister (NRP) og Nasjonalt kreftregister vil alle diagnoser fra identifiserte diabeteseksponerte og kontroller bli identifisert.
2. I National Drug Prescription Database vil all informasjon om reseptbelagte legemidler om identifiserte diabeteseksponerte og kontroller bli identifisert.
3. I det nasjonale dødsregisteret vil alle diagnoser fra identifiserte diabeteseksponerte og kontroller bli identifisert.

Endepunkter Sykelighet: diabeteseksponerte vs. kontroller fra bakgrunnsbefolkningen Medisinsk behandling: diabeteseksponerte vs. kontroller fra bakgrunnsbefolkningen Dødelighet: diabeteseksponerte vs. kontroller fra bakgrunnsbefolkningen

Statistikk Insidensrater vil bli beregnet som nye tilfeller per 100.000 per år og analysert ved Poisson-regresjon. Via Danmarks Statistik vil kontroller bli identifisert og matchet på riktig måte.

Morbiditet og mortalitet vil bli analysert ved Kaplan-Meier-statistikken, med log-rank test og Cox regresjon med relevante kovariater.

Studie III: Delstudie (n=50 diabeteseksponerte og n=50 ikke-eksponerte kontroller i alderen 18-19 år) Avkom etter mødre med type 1 diabetes, født før 1. januar 1994 (over 18 år ved dato for invitasjon), og hvem som deltok i studie A vil bli invitert til å delta i studie B. Studie B forventes å involvere omtrent 50 diabeteseksponerte og omtrent 50 ueksponerte kontroller i alderen 18 - 19 år ved undersøkelsestidspunktet. Studiegruppene vil bli matchet etter BMI, kjønn, fødselsdato og fysisk aktivitetsnivå. Alle deltakere bør være medikamentnaive og friske med en BMI mellom 20 og 30, og kontroller bør ikke ha noen familiehistorie med diabetes. Siden alle deltakere vil være over 18 år, vil de kunne gi informert skriftlig samtykke.

Ekskluderingskriterier:

1. Enhver ukjent sykdom eller behov for medisiner som oppstår etter inkludering,
2. Unormalt EKG, screening av blodprøver og/eller alvorlig hypertensjon, og
3. Nedsatt glukosetoleranse hos ikke-diabetikere.

Den utvalgte undergruppen av avkom av mødre med type 1-diabetes og matchede kontroller vil bli undersøkt ved hjelp av state-of-the-art metabolsk karakterisering ved bruk av euglykemisk-hyperinsulinemisk klemme med sporglukose kombinert med indirekte kalorimetri som tillater pålitelige estimater av glukosedisponeringsrater i hele kroppen, endogen glukoseproduksjon og glukose og lipidoksidasjon. I tillegg vil vurdering av fysisk aktivitetsnivå ved hjelp av IPAQ-spørreskjemaet bli supplert med studier av maksimalt oksygenforbruk (VO2max). Under klemmestudiene ble vevsbiopsier fra subkutant bukfett og lårmuskel (m. vastus lateralis) vil bli innhentet for studier av potensielle langsiktige molekylære konsekvenser av intrauterin eksponering for hyperglykemi - metabolsk fødselsminne. Dette vil inkludere bruk av flere oppdagelsesmoduser (hypotesefri), globale tilnærminger som transkripsjonsprofilering ved bruk av mikroarray-baserte teknologier, kvantitativ proteomikk, bioinformatikk inkludert baneanalyse og påfølgende validering av observerte abnormiteter ved bruk av qRT-PCR, immunoblotting og annet mer klassisk protein teknologier.

Eksamener:

Fysisk aktivitet (dag 1)

Barna og deres foreldre vil bli bedt om å fylle ut et spørreskjema som tar for seg psykososiale og demografiske aspekter og selvrapportert fysisk aktivitet (IPAQ-spørreskjema). VO2-maks bestemmes ved en gradert maksimal test (VO2-topp) på et syklusergometer ved bruk av indirekte kalorimetri.

Toppmoderne metabolsk karakterisering (dag 2):

Euglykemisk-hyperinsulinemisk klemme. Pasienter legges inn etter en 12-timers faste over natten til senteret ved Odense Universitetssykehus. De blir bedt om å innta et standardisert kosthold, og å avstå fra fysisk aktivitet i 48 timer før eksperimentene. Studieobjektene undersøkes med en euglykemisk-hyperinsulinemisk klemme (insulin 40mU/min/m2 i 4-t) ved bruk av sporingsteknologi som beskrevet55. Studiene er kombinert med indirekte kalorimetri som tillater estimater av glukoseavhendingshastigheter, endogen glukoseproduksjon, glukose- og lipidoksidasjon og ikke-oksidativ glukosemetabolisme som beskrevet. Blodprøver tas hvert 20. minutt under klemmen for vurdering av plasmaglukose, FFA, adipokiner og seruminsulin og C-peptid. Under de basale og insulinstimulerte tilstandene tas vevsbiopsier fra m. vastus lateralis og subkutant bukfett ved bruk av en modifisert Bergstrom-nål med sug under lokalbedøvelse. Hver biopsi fryses raskt i flytende nitrogen innen 30 s og lagres ved -130°C for senere analyse som beskrevet nedenfor. Kroppsfett (%) bestemmes av bioimpedansmetoden.

Transkriptomikk og proteomisk analyse av skjelettmuskulatur og fettvev inkluderer:

Mikroarray-basert transkripsjonsprofilering og biologisk veianalyse:

Oppdagelsesmodus kvantitativ proteomikk av vevsbiopsier:

Målrettet kvantitativ proteomikk:

Kvantitativ RT-PCR

Immunblotting

Genetisk analyse:

Analyse av DNA-metylering

Helgenom-metyleringsanalyse

Metyleringssensitiv høyoppløselig smelteanalyse (MS-HRM)

Genekspresjonsanalyse

Sekvensering

Statistisk analyse Mann-Whitney U-test vil bli brukt for å vurdere for hver CpG om to grupper hadde samme fordeling av metylering. For å eliminere prober som ikke fungerte og andre divergerende verdier, vil betaverdier i hver gruppe trimmes for ekstremer før beregningen av gjennomsnittlig betaverdi. Deretter vil bare gener med den høyeste 5 % halen av de absolutte gjennomsnittlige betaverdiforskjellene mellom de to gruppene bli valgt. Dermed vil CpG-er med en p-verdi under 0,005 og med de høyeste betaverdiforskjellene mellom de to gruppene bli brukt for identifisering av gener med statistisk signifikante diabetesspesifikke endringer i metylering. Sammenligning av array-metyleringsresultater med MS-HRM-resultater vil bli utført med en Mann-Whitney U-test og en Chi2-test for trend. Spearman-koeffisienter vil bli beregnet for å vurdere korrelasjonen mellom metylering og genuttrykk.

Nyhet og viktighet

Den raskt økende byrden av overvekt og hjerte- og karsykdommer er i ferd med å bli en trussel for både den enkelte og den globale økonomien. Det er derfor viktig å identifisere risikogrupper for å målrette forebyggende strategier. Eksponering for intrauterin hyperglykemi bidrar til epidemien gjennom en ond sirkel som overfører økt mottakelighet til neste generasjon via veier som bare er sparsomt forstått.

Denne studien inkluderer en svært stor kohort av diabeteseksponerte avkom av godt karakteriserte prospektivt studerte kvinner med type 1 diabetes. Den inkluderer informasjon om mors glykemi under graviditet, som er avgjørende for å vurdere mulige assosiasjoner med estimater av avkoms metabolisme og kognitiv funksjon. Den registerbaserte studien er unik og muliggjør innsamling av informasjon om sykelighet og dødelighet i hele kohorten. Den spesifikke molekylære signaturen til intrauterin eksponering for hyperglykemi i humant vev har så vidt vi vet ikke blitt undersøkt før, og selv om de ovennevnte studiene antyder mulig involvering av visse veier i skjelettmuskulatur og fettvev, er det viktig å undersøke det metabolske minnet av fødsel ved å bruke hypotesefrie, oppdagelsesmodus globale tilnærminger for å oppdage potensielle forstyrrelser i både forventede og uventede veier.