Salivary Raman COVID-19 Fingerprint

BAKGRUND/RATIONAL: Utbrottet av coronavirus sjukdom 2019 (COVID-19), orsakat av infektion med SARS-CoV-2, har snabbt spridit sig till att bli en världsomspännande pandemi. Global forskning fokuserade på förståelsen av den biokemiska infektionsmekanismen och på upptäckten av ett snabbt, känsligt och billigt diagnostiskt verktyg, som kan särskilja nuvarande och tidigare SARS-CoV-2-infektioner från en minimalt invasiv biovätska. Den snabba diagnosen av covid-19 är grundläggande för att begränsa och isolera de positiva fallen, och med ett snabbt ingripande minska infektionens spridning. Dessutom kan förutsägelsen av luftvägsinfektionens svårighetsgrad vara av avgörande betydelse för snabb identifiering och diskriminering mellan lindrigt kliniskt förlopp, svår sjukdom och akut andnödsyndrom (ARDS). En av de första infektionsställena för SARS-CoV-2 är munhålan där viruset kan binda och penetrera genom ACE2-receptorerna som finns på spottkörtlarnas epitelceller. Således kunde en hög koncentration av viruspartiklar hittas i saliv i de preliminära faserna av infektionen. Saliv är en komplex biovätska som består av bioaktiva molekyler som kan samlas upp med ett riktigt minimalt invasivt förfarande. Raman-spektroskopi är en icke-invasiv, snabb och etikettfri vibrationsteknik, som kan ge information om närvaro, koncentration, miljö, modifieringar och interaktioner av alla biokemiska arter som finns i en specifik biovätska. Med hjälp av Raman-spektroskopin kommer forskarna att analysera saliv som samlats in från friska försökspersoner, patienter som drabbats av covid-19 och försökspersoner med en tidigare infektion av covid-19. Data som samlas in kommer att analyseras och användas för att skapa en Raman-databas som kan tillhandahålla en klassificeringsmodell baserad på maskininlärning. Möjligheten att övervaka och karakterisera ett potentiellt spottfingeravtryck av covid-19 kan vara av avgörande betydelse för övervakning och diskriminering av covid-19-personer med en aktuell och tidigare infektion från friska försökspersoner.

MÅL: Målet med projektet är att karakterisera och validera saliv Raman-fingeravtrycket av COVID-19, förstå de huvudsakliga biomolekylerna som är involverade i skillnaderna mellan de tre experimentella grupperna: 1) friska försökspersoner, 2) COVID-19 patienter och 3) försökspersoner med en tidigare infektion av covid-19. Den stora mängden Raman-data kommer att användas för att skapa en Raman-databas för saliv, som associerar varje data med den relativa kliniska data som samlas in. Raman-databasen kommer att användas för att skapa en klassificeringsmodell genom tillämpning av multivariat analys i termer av huvudkomponentanalys och linjär diskriminantanalys. Denna klassificeringsmodell kommer att tillhandahålla ett snabbt verktyg för diskriminering av covid-19-tillståndet, och eventuellt även tillhandahålla information om patientens andningsförlopp. Modellen kommer att översättas för applikationen till en bärbar Raman-spektrometer, vilket leder till skapandet av en Raman Point of Care METODER: Utgående från de preliminära resultaten och protokollen från Laboratory of Nanomedicine and Clinical Biophotonics (LABION) - IRCCS Fondazione Don Gnocchi Milano , kommer saliven som samlas in från varje experimentgrupp att analyseras med användning av Raman-spektroskopi. All data kommer att bearbetas för baslinjen, skiftningen och normaliseringen för att homogenisera de insamlade signalerna och på detta sätt skapa Raman-databasen. Det genomsnittliga spektrumet beräknat från varje grupp kommer att karakteriseras, vilket identifierar de huvudsakliga familjerna av biologiska molekyler som är ansvariga för de spektrala skillnaderna. I följd kommer alla spektra att bearbetas genom multivariat analys (huvudkomponentanalys och linjär diskriminantanalys) för att på detta sätt erhålla klassificeringsmodellen. LOOCV kommer att användas för träning av klassificeringsmodellen, som kommer att ifrågasättas med hjälp av delmängdsvalideringsanalysen. Den partiella korrelationskoefficienten (Pearsons och Spearmans korrelation) kommer att användas för Raman-korrelationen med den kliniska parametern (t.ex. COVID-19 kliniskt förlopp) med användning av som kontroll samvarierar ålder och kön på försökspersonerna. Klassificeringsmodellen kommer sedan att översättas och användas som vårdpunkt med hjälp av en bärbar Raman utrustad med en laser som sänder ut vid 785 nm, med en jämförbar spektral upplösning.

• PROVINSAMLING: Saliv kommer att samlas in med Salivette (SARSTEDT, Tyskland), enligt tillverkarens instruktioner. En bomullspinne kommer att föras in i patientens mun och tuggas i 60 sekunder. Salivuppsamlingen kommer att uppnås genom centrifugering av pinnen (1000 g x 2 min), där alla relaterade parametrar registreras (lagringstemperatur och tiden mellan uppsamling och analys). Alla insamlingsprocedurer kommer att utföras minst två timmar efter den sista måltiden och tandborstning.
• PROVBEHANDLING: Före analysen kommer saliv (3 ul) att deponeras på aluminiumfolie och torkas över natten. Aluminiumfolien är grundläggande för att uppnå den ytförbättrade Raman-spridningen, vilket ökar salivens Raman-signal.
• DATAINSAMLING: Raman-spektra kommer att förvärvas med ett Aramis Raman-mikroskop (Horiba Jobin-Yvon, Frankrike) utrustat med en laserljuskälla som arbetar vid 785 nm med 100 % (512mW) lasereffekt. Insamlingstiden kommer att ställas in på 30 sekunder med dubbel insamling och 2 sekunders fördröjningstid för att förhindra bildandet av artefaktspektra. Före varje analys kommer instrumentet att kalibreras med hjälp av referensbandet av kisel. Alla signaler kommer att inhämtas i området mellan 400 och 1600 cm-1 med en upplösning på 0,8 cm-1, och få minst 25 spektra efter en kvadratisk karta. Mjukvarupaketet LabSpec 6 (Horiba Jobin-Yvon) kommer att användas för kartdesign och förvärv av spektra.
• DATAANALYS: Alla data kommer att anpassas med hjälp av en fjärdegrads polynomkurva för att ställa in baslinjen och normaliseras i följd med hjälp av enhetsvektor. Bidraget från aluminium kommer att tas bort från varje spektrum. Den statistiska analysen kommer att utföras med den multivariata metoden. I korthet kommer principalkomponentanalys och linjär diskriminantanalys att tillämpas för att extrahera huvudkomponenterna och de kanoniska variablerna. Dessa funktioner kommer att användas för korsvalidering med utelämna en ut (LOOCV), subsetvalidering och korrelation med de kliniska parametrarna. Mann-Whitney kommer att utföras på PCs poäng för att verifiera skillnaderna statistiskt relevanta mellan de analyserade grupperna. Analysen kommer att utföras med Origin-programvara (OriginLab, USA)
• Korrelation: Partiell korrelation med Pearsons och Spearmans koefficienter kommer att utföras på de extraherade variablerna och de kliniska parametrarna, med användning av som kontrollkovariater av försökspersonernas ålder och kön. Endast värden med p < 0,001 kommer att betraktas som statistiskt relevanta.
• ÖVERSÄTTNING: Data och klassificeringsmodell kommer att tillämpas med en bärbar Raman utrustad med en laser som sänder ut vid 785 nm och med en spektral upplösning som är jämförbar med den som användes för den tidigare analysen.