A Salivary Raman COVID-19 ujjlenyomata

HÁTTÉR/INDOKOLÁS: A 2019-es koronavírus-betegség (COVID-19) kitörése, amelyet a SARS-CoV-2 fertőzés okoz, gyorsan elterjedt, és világméretű járványsá vált. A globális kutatás a biokémiai fertőzési mechanizmus megértésére, valamint egy gyors, érzékeny és olcsó diagnosztikai eszköz felfedezésére összpontosított, amely képes megkülönböztetni a jelenlegi és a múltbéli SARS-CoV-2 fertőzéseket egy minimálisan invazív biofluidtól. A COVID-19 gyors diagnosztizálása alapvető fontosságú a pozitív esetek korlátozása és elkülönítése érdekében, gyors beavatkozással csökkentve a fertőzés terjedését. Ezenkívül a légúti fertőzés súlyosságának előrejelzése kulcsfontosságú lehet az enyhe klinikai lefolyás, a súlyos betegség és az akut légúti distressz szindróma (ARDS) gyors azonosításában és megkülönböztetésében. A SARS-CoV-2 egyik első fertőzési helye a szájüreg, ahol a vírus képes megkötődni és áthatolni a nyálmirigyek hámsejtjein található ACE2 receptorokon. Így a fertőzés kezdeti szakaszában a nyálban magas vírusrészecskék koncentrációt lehetett találni. A nyál egy bioaktív molekulákból álló komplex biofluid, amely egy igazán minimális invazív eljárással gyűjthető össze. A Raman-spektroszkópia egy non-invazív, gyors és címkementes vibrációs technika, amely képes információt szolgáltatni egy adott biofluidban jelenlévő összes biokémiai faj jelenlétéről, koncentrációjáról, környezetéről, módosulásairól és kölcsönhatásairól. A Raman-spektroszkópia segítségével a vizsgálók egészséges alanyoktól, COVID-19-fertőzött betegektől és múltban COVID-19 fertőzésen átesett betegektől gyűjtött nyálat elemzik. Az összegyűjtött adatokat elemzik és felhasználják egy Raman-adatbázis létrehozására, amely képes a gépi tanuláson alapuló osztályozási modellt nyújtani. A lehetséges nyálas COVID-19-ujjlenyomat nyomon követésének és jellemzésének lehetősége kulcsfontosságú lehet azon COVID-19- alanyok monitorozása és megkülönböztetése szempontjából, akiknek az egészséges alanyok jelenlegi vagy múltbeli fertőzése van.

CÉLKITŰZÉSEK: A projekt célja a COVID-19 nyálban lévő Raman-ujjlenyomatának jellemzése és validálása, megértve a három kísérleti csoport közötti különbségekben szerepet játszó fő biomolekulákat: 1) egészséges alanyok, 2) COVID-19 betegek és 3) alanyok. múltbeli COVID-19 fertőzéssel. A nagy mennyiségű Raman-adatot egy nyálalapú Raman-adatbázis létrehozására fogják használni, minden adatot társítva az összegyűjtött relatív klinikai adatokkal. A Raman adatbázist egy osztályozási modell létrehozására használjuk fel, többváltozós elemzés alkalmazásával a főkomponens-analízis és a lineáris diszkriminancia analízis tekintetében. Ez a besorolási modell gyors eszközt fog nyújtani a COVID-19 állapot megkülönböztetésére, és potenciálisan információt nyújt a páciens légúti klinikai lefolyásáról is. A modellt lefordítják hordozható Raman spektrométerre történő alkalmazáshoz, ami egy Raman Point of Care létrehozásához vezet MÓDSZEREK: A Nanomedicina és Klinikai Biofotonikai Laboratórium (LABION) előzetes eredményeiből és protokolljaiból kiindulva - IRCCS Fondazione Don Gnocchi Milano , az egyes kísérleti csoportokból összegyűjtött nyálat Raman-spektroszkópiával elemezzük. Minden adatot feldolgozunk az alapvonalhoz, az eltoláshoz és a normalizáláshoz, hogy homogenizáljuk az összegyűjtött jeleket, és így létrehozzuk a Raman adatbázist. Az egyes csoportokból számított átlagos spektrumot jellemezzük, azonosítva a spektrális különbségekért felelős biológiai molekulák fő családjait. Egymás után az összes spektrumot többváltozós analízissel (főkomponens-analízis és lineáris diszkriminancia-analízis) dolgozzuk fel, így kapjuk meg az osztályozási modellt. A LOOCV-t az osztályozási modell betanítására használjuk, amelyet a részhalmaz validációs analízis segítségével kérdezünk meg. A részleges korrelációs együtthatót (Pearson- és Spearman-féle korreláció) használjuk a Raman-korrelációhoz a klinikai paraméterrel (pl. A COVID-19 klinikai lefolyása) kontrollként alkalmazva az alanyok korát és nemét kovariálja. Az osztályozási modellt ezután lefordítják és gondozási pontként használják egy hordozható Raman segítségével, amely 785 nm-en sugárzó lézerrel van felszerelve, összehasonlítható spektrális felbontással.

• MINTAGYŰJTÉS: A nyálat a Salivette-tel (SARSTEDT, Németország) gyűjtjük a gyártó utasításait követve. A vattapamacsot az alany szájába helyezik, és 60 másodpercig rágják. A nyálgyűjtés a tampon centrifugálásával (1000 g x 2 perc) történik, az összes kapcsolódó paraméter rögzítésével (tárolási hőmérséklet, valamint a begyűjtés és az elemzés közötti idő). Minden begyűjtési eljárást legalább két órával az utolsó étkezés és fogmosás után kell elvégezni.
• MINTAFELDOLGOZÁS: Az analízis előtt nyálat (3 ul) rakunk le alumíniumfóliára, és egy éjszakán át szárítjuk. Az alumínium fólia alapvető fontosságú a Surface Enhanced Raman Scattering eléréséhez, ami növeli a nyál Raman jelét.
• ADATGYŰJTÉS: A Raman-spektrumokat egy Aramis Raman mikroszkóp (Horiba Jobin-Yvon, Franciaország) segítségével veszik fel, amely 785 nm-en működő lézeres fényforrással van felszerelve, 100%-os (512mW) lézerteljesítménnyel. Az adatgyűjtési idő 30 másodpercre lesz beállítva kétszeres felvétellel és 2 másodperces késleltetési időre, hogy megakadályozzák a műtermék-spektrumok kialakulását. Minden elemzés előtt a műszert a szilícium referenciasáv segítségével kalibrálják. Az összes jelet a 400 és 1600 cm-1 közötti tartományban veszik fel, 0,8 cm-1 felbontással, négyzetes térkép alapján legalább 25 spektrumot. A LabSpec 6 (Horiba Jobin-Yvon) szoftvercsomagot térképtervezéshez és spektrumok felvételéhez használják majd.
• ADATELEMZÉS: Az összes adatot egy negyedik fokú polinomiális görbe segítségével illesztjük az alapvonal beállításához, és az egységvektor segítségével egymás után normalizáljuk. Az alumínium hozzájárulását minden spektrumból eltávolítják. A statisztikai elemzés többváltozós megközelítéssel történik. Röviden, a főkomponens-analízist és a lineáris diszkriminanciaanalízist alkalmazzuk a főkomponensek és a kanonikus változók kinyerésére. Ezeket a funkciókat a kihagyás keresztellenőrzéséhez (LOOCV), a részhalmazok validálásához és a klinikai paraméterekkel való korrelációhoz fogják használni. A Mann-Whitney-t PC-pontszámokon végzik el, hogy igazolják a statisztikailag releváns különbségeket az elemzett csoportok között. Az elemzés az Origin szoftverrel (OriginLab, USA) történik.
• KORRELÁCIÓ: A Pearson- és Spearman-koefficiensekkel való részleges korrelációt végezzük a kivont változókon és a klinikai paramétereken, kontroll kovariánsként az alanyok korát és nemét használva. Csak a p < 0,001 értékeket tekintjük statisztikailag relevánsnak.
• FORDÍTÁS: Az adatokat és az osztályozási modellt egy hordozható Raman-nal alkalmazzuk, amely 785 nm-en kibocsátó lézerrel van felszerelve, és amelynek spektrális felbontása hasonló az előző elemzéshez.