Ślinowy odcisk palca Ramana COVID-19

TŁO/UZASADNIENIE: Wybuch choroby koronawirusowej 2019 (COVID-19), spowodowanej zakażeniem SARS-CoV-2, szybko rozprzestrzenił się, stając się ogólnoświatową pandemią. Globalne badania koncentrowały się na zrozumieniu biochemicznego mechanizmu infekcji oraz na odkryciu szybkiego, czułego i taniego narzędzia diagnostycznego, zdolnego do odróżnienia obecnych i przeszłych infekcji SARS-CoV-2 od minimalnie inwazyjnego biopłynu. Szybka diagnoza COVID-19 ma fundamentalne znaczenie dla ograniczenia i izolacji pozytywnych przypadków, zmniejszając wraz z szybką interwencją rozprzestrzenianie się infekcji. Ponadto przewidywanie ciężkości infekcji dróg oddechowych może mieć kluczowe znaczenie dla szybkiej identyfikacji i rozróżnienia między łagodnym przebiegiem klinicznym, ciężką chorobą a zespołem ostrej niewydolności oddechowej (ARDS). Jednym z pierwszych miejsc zakażenia SARS-CoV-2 jest jama ustna, w której wirus może wiązać się i przenikać przez receptory ACE2 obecne na komórkach nabłonkowych gruczołów ślinowych. Tak więc wysokie stężenie cząstek wirusa można było znaleźć w ślinie we wstępnych fazach infekcji. Ślina to złożony biopłyn składający się z bioaktywnych cząsteczek, które można pobrać za pomocą naprawdę minimalnie inwazyjnej procedury. Spektroskopia ramanowska to nieinwazyjna, szybka i wolna od znaczników technika wibracyjna, zdolna do dostarczenia informacji dotyczących obecności, stężenia, środowiska, modyfikacji i interakcji wszystkich form biochemicznych obecnych w określonym płynie biologicznym. Za pomocą spektroskopii ramanowskiej badacze przeanalizują ślinę pobraną od osób zdrowych, pacjentów dotkniętych COVID-19 oraz osób z przebytą infekcją COVID-19. Zebrane dane zostaną przeanalizowane i wykorzystane do stworzenia bazy Ramana, która będzie w stanie dostarczyć model klasyfikacji oparty na uczeniu maszynowym. Możliwość monitorowania i scharakteryzowania potencjalnego odcisku palca COVID-19 w ślinie może mieć kluczowe znaczenie dla monitorowania i rozróżniania osób z COVID-19 z obecną i przebytą infekcją od osób zdrowych.

CELE: Celem projektu jest scharakteryzowanie i walidacja ramanowskiego odcisku palca COVID-19 w ślinie, zrozumienie głównych biomolekuł zaangażowanych w różnice między trzema grupami eksperymentalnymi: 1) osobami zdrowymi, 2) pacjentami z COVID-19 i 3) osobami badanymi z przebytą infekcją COVID-19. Duża ilość danych ramanowskich zostanie wykorzystana do stworzenia bazy danych Ramana dotyczącej śliny, łączącej poszczególne dane z zebranymi względnymi danymi klinicznymi. Baza Ramana zostanie wykorzystana do stworzenia modelu klasyfikacyjnego poprzez zastosowanie analizy wielowymiarowej w zakresie analizy głównych składowych oraz liniowej analizy dyskryminacyjnej. Ten model klasyfikacyjny zapewni szybkie narzędzie do różnicowania stanu COVID-19, potencjalnie dostarczając również informacji na temat przebiegu klinicznego układu oddechowego pacjenta. Model zostanie przetłumaczony do zastosowania w przenośnym spektrometrze Ramana, co doprowadzi do stworzenia Raman Point of Care METODY: Począwszy od wstępnych wyników i protokołów Laboratorium Nanomedycyny i Biofotoniki Klinicznej (LABION) - IRCCS Fondazione Don Gnocchi Milano , ślina pobrana od każdej grupy eksperymentalnej zostanie przeanalizowana przy użyciu spektroskopii ramanowskiej. Wszystkie dane będą przetwarzane dla linii bazowej, przesunięcia i normalizacji w celu ujednolicenia zebranych sygnałów i stworzenia w ten sposób bazy ramanowskiej. Scharakteryzowane zostanie średnie widmo obliczone z każdej grupy, identyfikując główne rodziny cząsteczek biologicznych odpowiedzialnych za różnice widmowe. Kolejno wszystkie widma zostaną poddane analizie wielowymiarowej (analiza głównych składowych i liniowa analiza dyskryminacyjna) uzyskując w ten sposób model klasyfikacyjny. LOOCV będzie używany do trenowania modelu klasyfikacji, który będzie kwestionowany za pomocą analizy walidacyjnej podzbioru. Do korelacji ramanowskiej z parametrem klinicznym (np. przebieg kliniczny COVID-19) wykorzystując jako kontrolną współzmienną wiek i płeć badanych. Model klasyfikacyjny zostanie następnie przetłumaczony i wykorzystany jako punkt opieki przy użyciu przenośnego Ramana wyposażonego w laser emitujący fale o długości fali 785 nm, o porównywalnej rozdzielczości spektralnej.

• POBIERANIE PRÓBEK: Ślina zostanie pobrana za pomocą Salivette (SARSTEDT, Niemcy), zgodnie z instrukcjami producenta. Wacik jest wkładany do ust pacjenta i żuty przez 60 sekund. Pobranie śliny nastąpi poprzez odwirowanie wymazówki (1000 g x 2 min), rejestrując wszystkie związane z tym parametry (temperatura przechowywania i czas między pobraniem a analizą). Wszystkie zabiegi pobraniowe będą wykonywane co najmniej dwie godziny po ostatnim posiłku i umyciu zębów.
• PRZYGOTOWANIE PRÓBKI: Przed analizą ślina (3 ul) zostanie naniesiona na folię aluminiową i wysuszona przez noc. Folia aluminiowa ma fundamentalne znaczenie dla uzyskania wzmocnionego rozpraszania Ramana na powierzchni, zwiększając sygnał ramanowski śliny.
• ZBIERANIE DANYCH: Widma ramanowskie będą pozyskiwane przy użyciu mikroskopu ramanowskiego Aramis (Horiba Jobin-Yvon, Francja) wyposażonego w źródło światła laserowego o długości fali 785 nm i mocy lasera 100% (512 mW). Czas akwizycji zostanie ustawiony na 30 sekund z podwójną akwizycją i 2-sekundowym opóźnieniem, aby zapobiec powstawaniu widm artefaktów. Przed każdą analizą przyrząd zostanie skalibrowany przy użyciu wzorcowego pasma krzemu. Wszystkie sygnały będą zbierane w obszarze między 400 a 1600 cm-1 z rozdzielczością 0,8 cm-1, uzyskując co najmniej 25 widm zgodnie z kwadratową mapą. Pakiet oprogramowania LabSpec 6 (Horiba Jobin-Yvon) zostanie wykorzystany do projektowania map i akwizycji widm.
• ANALIZA DANYCH: Wszystkie dane zostaną dopasowane przy użyciu krzywej wielomianu czwartego stopnia, aby ustawić linię bazową, a następnie znormalizowane za pomocą wektora jednostkowego. Wkład aluminium zostanie usunięty z każdego widma. Analiza statystyczna zostanie przeprowadzona z wykorzystaniem podejścia wielowymiarowego. W skrócie, analiza głównych składowych i liniowa analiza dyskryminacyjna zostaną zastosowane do wyodrębnienia głównych składowych i zmiennych kanonicznych. Funkcje te zostaną wykorzystane do walidacji krzyżowej typu „pomiń jeden” (LOOCV), walidacji podzbioru i korelacji z parametrami klinicznymi. Mann-Whitney zostanie przeprowadzony na wynikach PC w celu zweryfikowania statystycznie istotnych różnic między analizowanymi grupami. Analiza zostanie przeprowadzona przy użyciu oprogramowania Origin (OriginLab, USA)
• KORELACJA: Częściowa korelacja ze współczynnikami Pearsona i Spearmana zostanie przeprowadzona na wyodrębnionych zmiennych i parametrach klinicznych, wykorzystując jako współzmienne kontrolne wiek i płeć badanych. Tylko wartości z p < 0,001 będą uważane za statystycznie istotne.
• TŁUMACZENIE: Dane i model klasyfikacyjny zostaną zastosowane za pomocą przenośnego Ramana wyposażonego w laser emitujący fale o długości fali 785 nm io rozdzielczości spektralnej porównywalnej z zastosowaną w poprzedniej analizie.