Salivary Raman COVID-19 -sormenjälki

TAUSTA/PERUSTELUT: SARS-CoV-2-infektion aiheuttama koronavirustauti 2019 (COVID-19) on levinnyt nopeasti maailmanlaajuiseksi pandemiaksi. Maailmanlaajuinen tutkimus keskittyi biokemiallisen tartuntamekanismin ymmärtämiseen ja nopean, herkän ja halvan diagnostisen työkalun löytämiseen, joka pystyy erottamaan nykyiset ja menneet SARS-CoV-2-infektiot minimaalisesti invasiivisista bionesteistä. COVID-19:n nopea diagnosointi on olennaista positiivisten tapausten rajoittamiseksi ja eristämiseksi, mikä vähentää tartunnan leviämistä nopealla toimenpiteellä. Lisäksi hengitystieinfektion vaikeusasteen ennustaminen voi olla ratkaisevan tärkeää lievän kliinisen kulun, vakavan sairauden ja akuutin hengitysvaikeusoireyhtymän (ARDS) nopean tunnistamisen ja erottamisen kannalta. Yksi ensimmäisistä SARS-CoV-2-infektiopaikoista on suuontelo, jossa virus pystyy sitoutumaan ja tunkeutumaan sylkirauhasten epiteelisoluissa olevien ACE2-reseptorien läpi. Siten syljestä voitiin havaita suuri pitoisuus viruspartikkeleita infektion alkuvaiheissa. Sylki on monimutkainen bioneste, joka koostuu bioaktiivisista molekyyleistä, jotka voidaan kerätä todella minimaalisesti invasiivisella toimenpiteellä. Raman-spektroskopia on ei-invasiivinen, nopea ja leimaton värähtelytekniikka, joka pystyy tarjoamaan tietoa kaikkien tietyssä bionesteessä olevien biokemiallisten lajien läsnäolosta, pitoisuudesta, ympäristöstä, muunnelmista ja vuorovaikutuksista. Raman-spektroskopiaa käyttämällä tutkijat analysoivat sylkeä, joka on kerätty terveiltä henkilöiltä, ​​potilailta, joilla on COVID-19-tartunta, ja potilailta, joilla on aiemmin ollut COVID-19-infektio. Kerätyt tiedot analysoidaan ja niitä käytetään Raman-tietokannan luomiseen, joka pystyy tarjoamaan koneoppimiseen perustuvan luokitusmallin. Mahdollisuus seurata ja karakterisoida mahdollista syljen COVID-19-sormenjälkeä voi olla ratkaisevan tärkeä sellaisten COVID-19-potilaiden seurannassa ja syrjinnässä, joilla on nykyinen tai aiempi infektio terveistä koehenkilöistä.

TAVOITTEET: Projektin tavoitteena on karakterisoida ja validoida COVID-19:n syljen Raman-sormenjälki ja ymmärtää tärkeimmät biomolekyylit, jotka liittyvät kolmen koeryhmän välisiin eroihin: 1) terveet koehenkilöt, 2) COVID-19-potilaat ja 3) koehenkilöt. joilla on mennyt COVID-19-infektio. Suuri määrä Raman-dataa käytetään syljen Raman-tietokannan luomiseen, jossa jokainen data yhdistetään kerättyihin suhteellisiin kliinisiin tietoihin. Raman-tietokantaa käytetään luokittelumallin luomiseen soveltamalla monimuuttujaanalyysiä pääkomponenttianalyysin ja lineaarisen erotteluanalyysin osalta. Tämä luokittelumalli tarjoaa nopean työkalun COVID-19-tilan erotteluun ja tarjoaa mahdollisesti myös tietoa potilaan hengitysteiden kliinisestä kulusta. Malli käännetään käytettäväksi kannettavaan Raman-spektrometriin, mikä johtaa Raman Point of Care -hoitopisteen luomiseen MENETELMÄT: Lähtökohtana nanolääketieteen ja kliinisen biofotoniikan laboratorion (LABION) alustavista tuloksista ja protokollista - IRCCS Fondazione Don Gnocchi Milano , kustakin koeryhmästä kerätty sylki analysoidaan käyttämällä Raman-spektroskopiaa. Kaikki tiedot käsitellään perusviivaa, siirtoa ja normalisointia varten kerättyjen signaalien homogenisoimiseksi ja Raman-tietokannan luomiseksi tällä tavalla. Jokaisesta ryhmästä laskettu keskimääräinen spektri karakterisoidaan tunnistamalla tärkeimmät biologisten molekyylien perheet, jotka ovat vastuussa spektrieroista. Peräkkäin kaikki spektrit käsitellään monimuuttuja-analyysillä (pääkomponenttianalyysi ja lineaarinen erotteluanalyysi), jolloin saadaan tällä tavalla luokittelumalli. Luokittelumallin koulutuksessa käytetään LOOCV:tä, joka kyseenalaistetaan osajoukon validointianalyysillä. Osittaista korrelaatiokerrointa (Pearsonin ja Spearmanin korrelaatio) käytetään Raman-korrelaatioon kliinisen parametrin kanssa (esim. COVID-19:n kliininen kulku) käyttämällä kontrollina kovarioituja koehenkilöiden ikää ja sukupuolta. Luokitusmalli käännetään sitten ja sitä käytetään hoitopisteenä käyttämällä kannettavaa Raman-laitetta, joka on varustettu laserilla, joka emittoi 785 nm:ssä ja jonka spektriresoluutio on vertailukelpoinen.

• NÄYTTEEN KERÄÄMINEN: Sylki kerätään Salivettella (SARSTEDT, Saksa) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Vanupuikko työnnetään tutkittavan suuhun ja sitä pureskellaan 60 sekunnin ajan. Syljenkeräys saadaan aikaan sentrifugoimalla vanupuikko (1000 g x 2 min) ja tallentamalla kaikki asiaan liittyvät parametrit (säilytyslämpötila sekä keräyksen ja analyysin välinen aika). Kaikki keräystoimenpiteet suoritetaan vähintään kaksi tuntia viimeisen aterian ja hampaiden harjauksen jälkeen.
• NÄYTTEEN KÄSITTELY: Ennen analyysiä sylki (3 ul) levitetään alumiinifolioon ja kuivataan yön yli. Alumiinifolio on välttämätön Surface Enhanced Raman -sironnan saavuttamiseksi, mikä lisää syljen Raman-signaalia.
• TIETOJEN KERÄÄMINEN: Raman-spektrit hankitaan Aramis Raman -mikroskoopilla (Horiba Jobin-Yvon, Ranska), joka on varustettu laservalonlähteellä, joka toimii 785 nm:ssä 100 % (512mW) laserteholla. Keräysajaksi asetetaan 30 sekuntia kaksinkertaisella hankinnalla ja 2 sekunnin viive, jotta estetään artefaktispektrien muodostuminen. Ennen jokaista analyysiä instrumentti kalibroidaan käyttämällä piivertailunauhaa. Kaikki signaalit hankitaan alueella 400-1600 cm-1 resoluutiolla 0,8 cm-1, jolloin saadaan vähintään 25 spektriä neliökartan perusteella. Karttasuunnittelussa ja spektrien hankinnassa käytetään ohjelmistopakettia LabSpec 6 (Horiba Jobin-Yvon).
• TIETOJEN ANALYYSI: Kaikki tiedot sovitetaan käyttämällä neljännen asteen polynomikäyrää perusviivan asettamiseksi ja normalisoidaan peräkkäin käyttämällä yksikkövektoria. Alumiinin osuus poistetaan jokaiselta spektriltä. Tilastollinen analyysi suoritetaan käyttämällä monimuuttujamenetelmää. Lyhyesti sanottuna pääkomponenttianalyysiä ja lineaarista erotteluanalyysiä sovelletaan pääkomponenttien ja kanonisten muuttujien erottamiseen. Näitä ominaisuuksia käytetään LOOCV-ristivalidointiin, osajoukon validointiin ja korrelaatioon kliinisten parametrien kanssa. Mann-Whitney suoritetaan PC-pisteillä analysoitujen ryhmien tilastollisesti merkityksellisten erojen tarkistamiseksi. Analyysi suoritetaan Origin-ohjelmistolla (OriginLab, USA)
• KORRELAATIO: Osittainen korrelaatio Pearsonin ja Spearmanin kertoimien kanssa suoritetaan erotetuille muuttujille ja kliinisille parametreille käyttämällä vertailukovariaatteina koehenkilöiden ikää ja sukupuolta. Vain arvot, joiden p < 0,001, katsotaan tilastollisesti merkityksellisiksi.
• KÄÄNNÖS: Tietoja ja luokitusmallia sovelletaan kannettavaan Raman-laitteeseen, joka on varustettu laserilla, joka emittoi 785 nm:ssä ja jonka spektriresoluutio on verrattavissa edelliseen analyysiin käytettyyn.