Slinný Ramanův otisk COVID-19

SOUVISLOSTI/ODŮVODNĚNÍ: Propuknutí koronavirové nemoci 2019 (COVID-19), způsobené infekcí SARS-CoV-2, se rychle rozšířilo a stalo se celosvětovou pandemií. Globální výzkum zaměřený na pochopení biochemického infekčního mechanismu a na objev rychlého, citlivého a levného diagnostického nástroje, schopného rozlišit současné a minulé infekce SARS-CoV-2 od minimálně invazivní biotekutiny. Rychlá diagnostika COVID-19 je zásadní pro omezení a izolaci pozitivních případů, přičemž rychlým zásahem se snižuje šíření infekce. Kromě toho by předpověď závažnosti respirační infekce mohla mít zásadní význam pro rychlou identifikaci a rozlišení mezi mírným klinickým průběhem, závažným onemocněním a syndromem akutní respirační tísně (ARDS). Jedním z prvních míst infekce SARS-CoV-2 je dutina ústní, kde je virus schopen se vázat a pronikat přes ACE2 receptory přítomné na epiteliálních buňkách slinných žláz. Vysoká koncentrace virových částic tak mohla být nalezena ve slinách v předběžných fázích infekce. Sliny jsou komplexní biotekutina složená z bioaktivních molekul, které lze odebírat skutečně minimálně invazivním postupem. Ramanova spektroskopie je neinvazivní, rychlá vibrační technika bez označení, která je schopna poskytnout informace týkající se přítomnosti, koncentrace, prostředí, modifikací a interakcí všech biochemických druhů přítomných v konkrétní biotekutině. Pomocí Ramanovy spektroskopie budou výzkumníci analyzovat sliny odebrané zdravým subjektům, pacientům postiženým COVID-19 a subjektům s prodělanou infekcí COVID-19. Shromážděná data budou analyzována a použita k vytvoření Ramanovy databáze schopné poskytnout klasifikační model založený na strojovém učení. Možnost monitorovat a charakterizovat potenciální otisk COVID-19 ve slinách by mohla mít zásadní význam pro sledování a diskriminaci subjektů COVID-19 se současnou a prodělanou infekcí od zdravých subjektů.

CÍLE: Cílem projektu je charakterizovat a ověřit slinný Ramanův otisk prstu COVID-19, pochopit hlavní biomolekuly podílející se na rozdílech mezi třemi experimentálními skupinami: 1) zdraví jedinci, 2) pacienti COVID-19 a 3) jedinci s prodělanou infekcí COVID-19. Velké množství Ramanových dat bude použito k vytvoření slinné Ramanovy databáze, která spojí všechna data s relativními shromážděnými klinickými daty. Ramanova databáze bude použita pro vytvoření klasifikačního modelu prostřednictvím aplikace vícerozměrné analýzy z hlediska analýzy hlavních komponent a lineární diskriminační analýzy. Tento klasifikační model poskytne rychlý nástroj pro rozlišení stavu COVID-19 a potenciálně poskytne také informace o respiračním klinickém průběhu pacienta. Model bude přeložen pro aplikaci na přenosný Ramanův spektrometr, což povede k vytvoření Ramanova bodu péče METODY: Vycházíme z předběžných výsledků a protokolů Laboratoře nanomedicíny a klinické biofotoniky (LABION) – IRCCS Fondazione Don Gnocchi Milano Sliny odebrané z každé experimentální skupiny budou analyzovány pomocí Ramanovy spektroskopie. Všechna data budou zpracována pro základní linii, posun a normalizaci s cílem homogenizovat shromážděné signály a vytvořit tímto způsobem Ramanovu databázi. Bude charakterizováno průměrné spektrum vypočítané z každé skupiny, přičemž se identifikují hlavní rodiny biologických molekul odpovědných za spektrální rozdíly. Následně budou všechna spektra zpracována pomocí vícerozměrné analýzy (analýza hlavních složek a lineární diskriminační analýza), čímž se získá klasifikační model. LOOCV bude použit pro trénování klasifikačního modelu, který bude zpochybněn pomocí validační analýzy podmnožin. Pro Ramanovu korelaci s klinickým parametrem (např. klinický průběh COVID-19) používající jako kontrolu kovariáty věku a pohlaví subjektů. Klasifikační model bude poté přeložen a použit jako bod péče pomocí přenosného Ramana vybaveného laserem emitujícím při 785 nm se srovnatelným spektrálním rozlišením.

• ODBĚR VZORKŮ: Sliny budou odebírány pomocí Salivette (SARSTEDT, Německo), podle pokynů výrobce. Vatový tampon se vloží do úst subjektu a žvýká se po dobu 60 sekund. Odběr slin bude proveden centrifugací tamponu (1000 g x 2 min), zaznamenáváním všech souvisejících parametrů (teplota skladování a doba mezi odběrem a analýzou). Všechny odběrové procedury budou provedeny minimálně dvě hodiny po posledním jídle a vyčištění zubů.
• ZPRACOVÁNÍ VZORKU: Před analýzou se sliny (3 ul) nanesou na hliníkovou fólii a suší se přes noc. Hliníková fólie je zásadní pro dosažení Ramanova rozptylu s vylepšeným povrchem, který zvyšuje Ramanův signál slin.
• SBĚR DAT: Ramanova spektra budou získána pomocí mikroskopu Aramis Raman (Horiba Jobin-Yvon, Francie) vybaveného laserovým světelným zdrojem pracujícím při 785 nm se 100% (512 mW) výkonem laseru. Doba akvizice bude nastavena na 30 sekund s dvojitou akvizicí a 2 sekundovou prodlevou, aby se zabránilo tvorbě spekter artefaktů. Před každou analýzou bude přístroj zkalibrován pomocí referenčního pásu křemíku. Všechny signály budou pořízeny v oblasti mezi 400 a 1600 cm-1 s rozlišením 0,8 cm-1, přičemž budou získány alespoň 25 spekter podle čtvercové mapy. Pro návrh map a pořizování spekter bude použit softwarový balík LabSpec 6 (Horiba Jobin-Yvon).
• ANALÝZA DAT: Všechna data budou proložena pomocí polynomické křivky čtvrtého stupně pro nastavení základní linie a následně normalizována pomocí jednotkového vektoru. Příspěvek hliníku bude odstraněn z každého spektra. Statistická analýza bude provedena pomocí vícerozměrného přístupu. Stručně řečeno, analýza hlavních komponent a lineární diskriminační analýza budou použity k extrakci hlavních komponent a kanonických proměnných. Tyto funkce budou použity pro vynechání křížové validace (LOOCV), validaci podmnožiny a korelaci s klinickými parametry. Mann-Whitney bude proveden na skóre PC, aby se ověřily statisticky významné rozdíly mezi analyzovanými skupinami. Analýza bude provedena pomocí softwaru Origin (OriginLab, USA)
• KORELACE: Částečná korelace s Pearsonovými a Spearmanovými koeficienty bude provedena na extrahovaných proměnných a klinických parametrech s použitím jako kontrolních kovariátů věku a pohlaví subjektů. Za statisticky relevantní budou považovány pouze hodnoty s p < 0,001.
• PŘEKLAD: Data a klasifikační model budou aplikovány na přenosný Raman vybavený laserem emitujícím při 785 nm a se spektrálním rozlišením srovnatelným s rozlišením použitým pro předchozí analýzu.