La huella dactilar salival Raman COVID-19

ANTECEDENTES/FUNDAMENTO: El brote de la enfermedad por coronavirus 2019 (COVID-19), causado por la infección por SARS-CoV-2, se ha propagado rápidamente hasta convertirse en una pandemia mundial. La investigación global se centró en la comprensión del mecanismo infeccioso bioquímico y en el descubrimiento de una herramienta de diagnóstico rápida, sensible y económica, capaz de discriminar las infecciones actuales y pasadas por SARS-CoV-2 de un biofluido mínimamente invasivo. El diagnóstico rápido de COVID-19 es fundamental para limitar y aislar los casos positivos, disminuyendo con una pronta intervención la propagación de la infección. Además, la predicción de la gravedad de la infección respiratoria podría ser de crucial importancia para la rápida identificación y discriminación entre el curso clínico leve, la enfermedad grave y el Síndrome de Dificultad Respiratoria Aguda (SDRA). Uno de los primeros sitios de infección del SARS-CoV-2 es la cavidad oral donde el virus puede unirse y penetrar a través de los receptores ACE2 presentes en las células epiteliales de las glándulas salivales. Así, se pudo encontrar una alta concentración de partículas virales en la saliva en las fases preliminares de la infección. La saliva es un biofluido complejo compuesto por moléculas bioactivas que se pueden recolectar con un procedimiento mínimamente invasivo. La espectroscopia Raman es una técnica vibratoria no invasiva, rápida y sin etiquetas, capaz de proporcionar información sobre presencia, concentración, entorno, modificaciones e interacciones de todas las especies bioquímicas presentes en un biofluido específico. Usando la espectroscopia Raman, los investigadores analizarán la saliva recolectada de sujetos sanos, pacientes afectados por COVID-19 y sujetos con una infección pasada por COVID-19. Los datos recopilados se analizarán y utilizarán para crear una base de datos Raman capaz de proporcionar un modelo de clasificación basado en el aprendizaje automático. La posibilidad de monitorear y caracterizar una posible huella dactilar salival de COVID-19 podría ser de crucial importancia para el seguimiento y la discriminación de sujetos con COVID-19 con una infección actual y pasada de los sujetos sanos.

OBJETIVOS: El objetivo del proyecto es caracterizar y validar la huella Raman salival de COVID-19, entendiendo las principales biomoléculas involucradas en las diferencias entre los tres grupos experimentales: 1) sujetos sanos, 2) pacientes con COVID-19 y 3) sujetos con una infección pasada por COVID-19. La gran cantidad de datos Raman se utilizará para crear una base de datos Raman salival, asociando cada dato con los datos clínicos relativos recopilados. La base de datos Raman se utilizará para la creación de un modelo de clasificación mediante la aplicación de análisis multivariado en términos de análisis de componentes principales y análisis discriminante lineal. Este modelo de clasificación proporcionará una herramienta rápida para la discriminación de la condición de COVID-19, y potencialmente brindará también información sobre el curso clínico respiratorio del paciente. El modelo se traducirá para la aplicación a un espectrómetro Raman portátil, lo que conducirá a la creación de un Punto de Atención Raman MÉTODOS: A partir de los resultados preliminares y protocolos del Laboratorio de Nanomedicina y Biofotónica Clínica (LABION) - IRCCS Fondazione Don Gnocchi Milano , la saliva recogida de cada grupo experimental se analizará mediante espectroscopia Raman. Todos los datos serán procesados ​​para la línea base, turno y normalización con el fin de homogeneizar las señales recolectadas y creando así la base de datos Raman. Se caracterizará el espectro medio calculado de cada grupo, identificando las principales familias de moléculas biológicas responsables de las diferencias espectrales. Consecutivamente, todos los espectros serán procesados ​​mediante análisis multivariante (análisis de componentes principales y análisis discriminante lineal) obteniendo así el modelo de clasificación. LOOCV se utilizará para el entrenamiento del modelo de clasificación, que se cuestionará mediante el análisis de validación de subconjuntos. El coeficiente de correlación parcial (correlación de Pearson y de Spearman) se utilizará para la correlación de Raman con el parámetro clínico (p. Curso clínico COVID-19) utilizando como covariables de control la edad y el sexo de los sujetos. Luego, el modelo de clasificación se traducirá y utilizará como punto de atención mediante un Raman portátil equipado con un láser que emite a 785 nm, con una resolución espectral comparable.

• RECOGIDA DE MUESTRAS: La saliva se recogerá con Salivette (SARSTEDT, Alemania), siguiendo las instrucciones del fabricante. El hisopo de algodón se insertará en la boca del sujeto y se masticará durante 60 segundos. La recolección de saliva se logrará mediante la centrifugación del hisopo (1000 g x 2 min), registrando todos los parámetros relacionados (temperatura de almacenamiento y tiempo entre la recolección y el análisis). Todos los procedimientos de recolección se realizarán al menos dos horas después de la última comida y cepillado de dientes.
• PROCESAMIENTO DE LA MUESTRA: Antes del análisis, se depositará saliva (3 ul) sobre papel de aluminio y se secará durante la noche. El papel de aluminio es fundamental para lograr la Dispersión Raman Mejorada en la Superficie, aumentando la señal Raman de la saliva.
• RECOPILACIÓN DE DATOS: Los espectros Raman se adquirirán utilizando un microscopio Aramis Raman (Horiba Jobin-Yvon, Francia) equipado con una fuente de luz láser que opera a 785 nm con una potencia láser del 100 % (512 mW). El tiempo de adquisición se establecerá en 30 segundos con adquisición doble y un tiempo de retardo de 2 segundos para evitar la formación de espectros de artefactos. Antes de cada análisis, el instrumento será calibrado utilizando la banda de referencia de silicio. Todas las señales serán adquiridas en la región entre 400 y 1600 cm-1 con una resolución de 0,8 cm-1, adquiriendo al menos 25 espectros siguiendo un mapa cuadrado. El paquete de software LabSpec 6 (Horiba Jobin-Yvon) se utilizará para el diseño de mapas y la adquisición de espectros.
• ANÁLISIS DE DATOS: Todos los datos se ajustarán utilizando una curva polinomial de cuarto grado para establecer la línea de base y se normalizarán consecutivamente utilizando un vector unitario. La contribución del aluminio se eliminará de cada espectro. El análisis estadístico se realizará utilizando el enfoque multivariado. Brevemente, se aplicará el análisis de componentes principales y el análisis discriminante lineal para extraer los componentes principales y las variables canónicas. Estas funciones se utilizarán para la validación cruzada de exclusión (LOOCV), la validación de subconjuntos y la correlación con los parámetros clínicos. Mann-Whitney se realizará en puntajes de PC para verificar las diferencias estadísticamente relevantes entre los grupos analizados. El análisis se realizará utilizando el software Origin (OriginLab, EE. UU.)
• CORRELACIÓN: Se realizará correlación parcial con los coeficientes de Pearson y Spearman sobre las variables extraídas y los parámetros clínicos, utilizando como covariables de control la edad y el sexo de los sujetos. Solo se considerarán estadísticamente relevantes los valores con p < 0,001.
• TRADUCCIÓN: Los datos y el modelo de clasificación se aplicarán con un Raman portátil equipado con un láser que emite a 785 nm y con una resolución espectral comparable a la utilizada para el análisis anterior.