L'empreinte digitale salivaire Raman COVID-19

CONTEXTE/JUSTIFICATION : L'épidémie de maladie à coronavirus 2019 (COVID-19), causée par une infection par le SRAS-CoV-2, s'est rapidement propagée pour devenir une pandémie mondiale. La recherche mondiale s'est concentrée sur la compréhension du mécanisme infectieux biochimique et sur la découverte d'un outil de diagnostic rapide, sensible et bon marché, capable de discriminer les infections actuelles et passées par le SRAS-CoV-2 d'un biofluide mini-invasif. Le diagnostic rapide de COVID-19 est fondamental pour limiter et isoler les cas positifs, en diminuant avec une intervention rapide la propagation de l'infection. De plus, la prédiction de la gravité de l'infection respiratoire pourrait être d'une importance cruciale pour l'identification rapide et la discrimination entre l'évolution clinique bénigne, la maladie grave et le syndrome de détresse respiratoire aiguë (SDRA). L'un des premiers sites d'infection du SRAS-CoV-2 est la cavité buccale où le virus est capable de se lier et de pénétrer à travers les récepteurs ACE2 présents sur les cellules épithéliales des glandes salivaires. Ainsi, une forte concentration de particules virales a pu être retrouvée dans la salive dans les phases préliminaires de l'infection. La salive est un biofluide complexe composé de molécules bioactives qui peuvent être collectées avec une procédure très peu invasive. La spectroscopie Raman est une technique vibrationnelle non invasive, rapide et sans marquage, capable de fournir des informations sur la présence, la concentration, l'environnement, les modifications et les interactions de toutes les espèces biochimiques présentes dans un biofluide spécifique. À l'aide de la spectroscopie Raman, les enquêteurs analyseront la salive prélevée sur des sujets sains, des patients touchés par le COVID-19 et des sujets ayant déjà été infectés par le COVID-19. Les données collectées seront analysées et utilisées pour créer une base de données Raman capable de fournir un modèle de classification basé sur l'apprentissage automatique. La possibilité de surveiller et de caractériser une éventuelle empreinte salivaire COVID-19 pourrait être d'une importance cruciale pour le suivi et la discrimination des sujets COVID-19 avec une infection actuelle et passée des sujets sains.

OBJECTIFS : L'objectif du projet est de caractériser et valider l'empreinte Raman salivaire du COVID-19, en comprenant les principales biomolécules impliquées dans les différences entre les trois groupes expérimentaux : 1) sujets sains, 2) patients COVID-19 et 3) sujets avec une infection passée par COVID-19. La grande quantité de données Raman sera utilisée pour créer une base de données Raman salivaire, associant chaque donnée aux données cliniques relatives collectées. La base de données Raman sera utilisée pour la création d'un modèle de classification par l'application d'une analyse multivariée en termes d'analyse en composantes principales et d'analyse discriminante linéaire. Ce modèle de classification fournira un outil rapide pour la discrimination de l'état COVID-19, fournissant potentiellement également des informations sur l'évolution clinique respiratoire du patient. Le modèle sera traduit pour l'application à un spectromètre Raman portable, conduisant à la création d'un point de service Raman MÉTHODES : À partir des résultats préliminaires et des protocoles du Laboratoire de nanomédecine et de biophotonique clinique (LABION) - IRCCS Fondazione Don Gnocchi Milano , la salive recueillie de chaque groupe expérimental sera analysée par spectroscopie Raman. Toutes les données seront traitées pour la ligne de base, le décalage et la normalisation afin d'homogénéiser les signaux collectés et créer ainsi la base de données Raman. Le spectre moyen calculé à partir de chaque groupe sera caractérisé en identifiant les principales familles de molécules biologiques responsables des différences spectrales. Consécutivement, tous les spectres seront traités par analyse multivariée (analyse en composantes principales et analyse discriminante linéaire) obtenant ainsi le modèle de classification. LOOCV sera utilisé pour la formation du modèle de classification, qui sera interrogé à l'aide de l'analyse de validation du sous-ensemble. Le coefficient de corrélation partielle (corrélation de Pearson et de Spearman) sera utilisé pour la corrélation Raman avec le paramètre clinique (par ex. Cours clinique COVID-19) en utilisant comme covariables de contrôle l'âge et le sexe des sujets. Le modèle de classification sera ensuite traduit et utilisé comme point of care à l'aide d'un Raman portable équipé d'un laser émettant à 785 nm, avec une résolution spectrale comparable.

• PRÉLÈVEMENT D'ÉCHANTILLONS : La salive sera prélevée avec Salivette (SARSTEDT, Allemagne), en suivant les instructions du fabricant. Le coton-tige sera inséré dans la bouche du sujet et mâché pendant 60 secondes. La collecte de salive sera réalisée par centrifugation de l'écouvillon (1000 g x 2 min), en enregistrant tous les paramètres liés (température de stockage et temps entre le prélèvement et l'analyse). Toutes les procédures de collecte seront effectuées au moins deux heures après le dernier repas et le brossage des dents.
• TRAITEMENT DES ÉCHANTILLONS : Avant l'analyse, la salive (3 ul) sera déposée sur une feuille d'aluminium et séchée pendant une nuit. La feuille d'aluminium est fondamentale pour obtenir la diffusion Raman améliorée en surface, augmentant le signal Raman de la salive.
• COLLECTE DE DONNÉES : Les spectres Raman seront acquis à l'aide d'un microscope Aramis Raman (Horiba Jobin-Yvon, France) équipé d'une source de lumière laser fonctionnant à 785 nm avec une puissance laser de 100 % (512 mW). Le temps d'acquisition sera fixé à 30 secondes avec une double acquisition et un temps de retard de 2 secondes pour éviter la formation de spectres d'artefacts. Avant chaque analyse, l'instrument sera calibré à l'aide de la bande de référence du silicium. Tous les signaux seront acquis dans la région comprise entre 400 et 1600 cm-1 avec une résolution de 0,8 cm-1, acquérant au moins 25 spectres suivant une carte carrée. Le progiciel LabSpec 6 (Horiba Jobin-Yvon) sera utilisé pour la conception de cartes et l'acquisition de spectres.
• ANALYSE DES DONNÉES : Toutes les données seront ajustées à l'aide d'une courbe polynomiale du quatrième degré pour définir la ligne de base et normalisées consécutivement à l'aide d'un vecteur unitaire. La contribution de l'aluminium sera retirée de chaque spectre. L'analyse statistique sera effectuée en utilisant l'approche multivariée. Brièvement, l'analyse en composantes principales et l'analyse discriminante linéaire seront appliquées pour extraire les composantes principales et les variables canoniques. Ces caractéristiques seront utilisées pour la validation croisée leave one out (LOOCV), la validation de sous-ensembles et la corrélation avec les paramètres cliniques. Mann-Whitney sera effectué sur les scores PC pour vérifier les différences statistiquement pertinentes entre les groupes analysés. L'analyse sera effectuée à l'aide du logiciel Origin (OriginLab, USA)
• CORRÉLATION : Une corrélation partielle avec les coefficients de Pearson et de Spearman sera effectuée sur les variables extraites et les paramètres cliniques, en utilisant comme covariables de contrôle l'âge et le sexe des sujets. Seules les valeurs avec p < 0,001 seront considérées comme statistiquement pertinentes.
• TRADUCTION : Les données et le modèle de classification seront appliqués avec un Raman portable équipé d'un laser émettant à 785 nm et avec une résolution spectrale comparable à celle utilisée pour l'analyse précédente.