A impressão digital salivar Raman COVID-19

ANTECEDENTES/LÓGICA: O surto da doença de coronavírus 2019 (COVID-19), causada pela infecção de SARS-CoV-2, se espalhou rapidamente para se tornar uma pandemia mundial. A pesquisa global concentrou-se na compreensão do mecanismo infeccioso bioquímico e na descoberta de uma ferramenta de diagnóstico rápida, sensível e barata, capaz de discriminar as infecções atuais e passadas por SARS-CoV-2 a partir de um biofluido minimamente invasivo. O diagnóstico rápido do COVID-19 é fundamental para limitar e isolar os casos positivos, diminuindo com uma intervenção imediata a propagação da infecção. Além disso, a previsão da gravidade da infecção respiratória pode ser de importância crucial para a rápida identificação e discriminação entre curso clínico leve, doença grave e Síndrome do Desconforto Respiratório Agudo (SDRA). Um dos primeiros locais de infecção do SARS-CoV-2 é a cavidade oral, onde o vírus é capaz de se ligar e penetrar através dos receptores ACE2 presentes nas células epiteliais das glândulas salivares. Assim, uma alta concentração de partículas virais pode ser encontrada na saliva nas fases preliminares da infecção. A saliva é um biofluido complexo composto de moléculas bioativas que podem ser coletadas com um procedimento minimamente invasivo. A espectroscopia Raman é uma técnica vibracional não invasiva, rápida e livre de rótulos, capaz de fornecer informações sobre presença, concentração, ambiente, modificações e interações de todas as espécies bioquímicas presentes em um determinado biofluido. Usando a espectroscopia Raman, os investigadores analisarão a saliva coletada de indivíduos saudáveis, pacientes afetados pelo COVID-19 e indivíduos com infecção anterior pelo COVID-19. Os dados coletados serão analisados ​​e usados ​​para criar um banco de dados Raman capaz de fornecer um modelo de classificação baseado em aprendizado de máquina. A possibilidade de monitorar e caracterizar uma possível impressão digital salivar do COVID-19 pode ser de importância crucial para o monitoramento e discriminação de indivíduos com COVID-19 com uma infecção atual e passada de indivíduos saudáveis.

OBJETIVOS: O objetivo do projeto é caracterizar e validar a impressão digital Raman salivar do COVID-19, compreendendo as principais biomoléculas envolvidas nas diferenças entre os três grupos experimentais: 1) indivíduos saudáveis, 2) pacientes com COVID-19 e 3) indivíduos com infecção anterior por COVID-19. A grande quantidade de dados Raman será usada para criar um banco de dados Raman salivar, associando cada dado com os dados clínicos relativos coletados. A base de dados Raman será utilizada para a criação de um modelo de classificação através da aplicação de análise multivariada em termos de análise de componentes principais e análise discriminante linear. Este modelo de classificação fornecerá uma ferramenta rápida para a discriminação da condição de COVID-19, potencialmente fornecendo também informações sobre o curso clínico respiratório do paciente. O modelo será traduzido para aplicação em um espectrômetro Raman portátil, levando à criação de um Raman Point of Care MÉTODOS: A partir dos resultados preliminares e protocolos do Laboratório de Nanomedicina e Biofotônica Clínica (LABION) - IRCCS Fondazione Don Gnocchi Milano , a saliva coletada de cada grupo experimental será analisada por espectroscopia Raman. Todos os dados serão processados ​​para a linha de base, deslocamento e normalização, a fim de homogeneizar os sinais coletados e criar assim o banco de dados Raman. O espectro médio calculado de cada grupo será caracterizado, identificando as principais famílias de moléculas biológicas responsáveis ​​pelas diferenças espectrais. Consecutivamente, todos os espectros serão processados ​​através de análises multivariadas (análise de componentes principais e análise discriminante linear) obtendo-se assim o modelo de classificação. O LOOCV será utilizado para o treinamento do modelo de classificação, que será questionado por meio da análise de validação de subconjunto. O coeficiente de correlação parcial (correlação de Pearson e Spearman) será usado para a correlação de Raman com o parâmetro clínico (ex. curso clínico da COVID-19) usando como covariáveis ​​de controle a idade e o sexo dos sujeitos. O modelo de classificação será então traduzido e usado como ponto de atendimento usando um Raman portátil equipado com um laser que emite a 785 nm, com uma resolução espectral comparável.

• COLETA DE AMOSTRA: A saliva será coletada com Salivette (SARSTEDT, Alemanha), seguindo as instruções do fabricante. O cotonete será inserido na boca do sujeito e mastigado por 60 segundos. A coleta da saliva será realizada por centrifugação do swab (1000 g x 2 min), registrando-se todos os parâmetros relacionados (temperatura de armazenamento e tempo entre a coleta e a análise). Todos os procedimentos de coleta serão realizados no mínimo duas horas após a última refeição e escovação dos dentes.
• PROCESSAMENTO DA AMOSTRA: Antes da análise, a saliva (3 ul) será depositada em papel alumínio e seca durante a noite. A folha de alumínio é fundamental para alcançar o Surface Enhanced Raman Scattering, aumentando o sinal Raman da saliva.
• COLETA DE DADOS: Os espectros Raman serão adquiridos usando um microscópio Aramis Raman (Horiba Jobin-Yvon, França) equipado com uma fonte de luz laser operando a 785 nm com potência laser de 100% (512mW). O tempo de aquisição será definido em 30 segundos com aquisição dupla e tempo de atraso de 2 segundos para evitar a formação de espectros de artefatos. Antes de cada análise, o instrumento será calibrado usando a banda de referência de silício. Todos os sinais serão adquiridos na região entre 400 e 1600 cm-1 com resolução de 0,8 cm-1, adquirindo pelo menos 25 espectros seguindo um mapa quadrado. O pacote de software LabSpec 6 (Horiba Jobin-Yvon) será utilizado para o desenho do mapa e aquisição dos espectros.
• ANÁLISE DOS DADOS: Todos os dados serão ajustados usando uma curva polinomial de quarto grau para definir a linha de base e normalizados consecutivamente usando o vetor unitário. A contribuição do alumínio será removida de cada espectro. A análise estatística será realizada por meio da abordagem multivariada. Resumidamente, a análise de componentes principais e a análise discriminante linear serão aplicadas para extrair os componentes principais e as variáveis ​​canônicas. Esses recursos serão usados ​​para validação cruzada leave one out (LOOCV), validação de subconjunto e correlação com os parâmetros clínicos. Os escores de Mann-Whitney serão realizados nos PCs para verificar as diferenças estatisticamente relevantes entre os grupos analisados. A análise será realizada no software Origin (OriginLab, EUA)
• CORRELAÇÃO: Será realizada correlação parcial com os coeficientes de Pearson e Spearman sobre as variáveis ​​extraídas e os parâmetros clínicos, utilizando como covariáveis ​​de controle a idade e o sexo dos sujeitos. Somente valores com p < 0,001 serão considerados estatisticamente relevantes.
• TRADUÇÃO: Os dados e o modelo de classificação serão aplicados com um Raman portátil equipado com um laser que emite a 785 nm e com uma resolução espectral comparável à utilizada na análise anterior.