De speeksel Raman COVID-19-vingerafdruk

ACHTERGROND / RATIONALE: De uitbraak van coronavirusziekte 2019 (COVID-19), veroorzaakt door infectie van SARS-CoV-2, heeft zich snel verspreid tot een wereldwijde pandemie. Wereldwijd onderzoek richtte zich op het begrijpen van het biochemische infectiemechanisme en op de ontdekking van een snelle, gevoelige en goedkope diagnostische tool, die in staat is om de huidige en vroegere SARS-CoV-2-infecties te onderscheiden van een minimaal invasieve biovloeistof. De snelle diagnose van COVID-19 is van fundamenteel belang om de positieve gevallen te beperken en te isoleren, en met een snelle interventie de verspreiding van de infectie te verminderen. Bovendien zou de voorspelling van de ernst van de luchtweginfectie van cruciaal belang kunnen zijn voor de snelle identificatie en discriminatie tussen mild klinisch beloop, ernstige ziekte en Acute Respiratory Distress Syndrome (ARDS). Een van de eerste infectieplaatsen van SARS-CoV-2 is de mondholte waar het virus zich kan binden aan en kan doordringen via de ACE2-receptoren die aanwezig zijn op de epitheelcellen van de speekselklieren. Zo kon in het voorstadium van de infectie een hoge concentratie virusdeeltjes in het speeksel worden aangetroffen. Speeksel is een complexe biovloeistof die is samengesteld uit bioactieve moleculen die kunnen worden verzameld met een echt minimaal invasieve procedure. Raman-spectroscopie is een niet-invasieve, snelle en labelvrije trillingstechniek, die informatie kan verschaffen over aanwezigheid, concentratie, omgeving, modificaties en interacties van alle biochemische soorten die aanwezig zijn in een specifieke biovloeistof. Met behulp van de Raman-spectroscopie analyseren de onderzoekers speeksel dat is verzameld van gezonde proefpersonen, patiënten die zijn getroffen door COVID-19 en proefpersonen met een eerdere infectie door COVID-19. De verzamelde gegevens worden geanalyseerd en gebruikt om een ​​Raman-database te creëren die een classificatiemodel kan bieden op basis van machine learning. De mogelijkheid om een ​​potentiële COVID-19-vingerafdruk uit speeksel te monitoren en te karakteriseren, zou van cruciaal belang kunnen zijn voor het monitoren en onderscheiden van COVID-19-proefpersonen met een huidige en vroegere infectie van de gezonde proefpersonen.

DOELSTELLINGEN: Het doel van het project is om de speeksel Raman-vingerafdruk van COVID-19 te karakteriseren en te valideren, en inzicht te krijgen in de belangrijkste biomoleculen die betrokken zijn bij de verschillen tussen de drie experimentele groepen: 1) gezonde proefpersonen, 2) COVID-19-patiënten en 3) proefpersonen met een eerdere infectie door COVID-19. De grote hoeveelheid Raman-gegevens zal worden gebruikt om een ​​speeksel-Raman-database te creëren, waarbij elke gegevens worden gekoppeld aan de relatieve verzamelde klinische gegevens. De Raman-database zal worden gebruikt voor het creëren van een classificatiemodel door toepassing van multivariate analyse in termen van hoofdcomponentenanalyse en lineaire discriminantanalyse. Dit classificatiemodel zal een snel hulpmiddel zijn voor de discriminatie van de COVID-19-aandoening en mogelijk ook informatie verschaffen over het respiratoire klinische beloop van de patiënt. Het model zal voor de toepassing worden vertaald naar een draagbare Raman-spectrometer, wat zal leiden tot de creatie van een Raman Point of Care METHODEN: uitgaande van de voorlopige resultaten en protocollen van het Laboratorium voor Nanogeneeskunde en Klinische Biofotonica (LABION) - IRCCS Fondazione Don Gnocchi Milano , zal het speeksel van elke experimentele groep worden geanalyseerd met behulp van Raman-spectroscopie. Alle gegevens worden verwerkt voor de basislijn, verschuiving en normalisatie om de verzamelde signalen te homogeniseren en zo de Raman-database te creëren. Het gemiddelde spectrum berekend uit elke groep zal worden gekarakteriseerd, waarbij de belangrijkste families van biologische moleculen worden geïdentificeerd die verantwoordelijk zijn voor de spectrale verschillen. Achtereenvolgens zullen alle spectra worden verwerkt via multivariate analyse (hoofdcomponentenanalyse en lineaire discriminantanalyse) om op deze manier het classificatiemodel te verkrijgen. LOOCV zal worden gebruikt voor de training van het classificatiemodel, dat zal worden bevraagd met behulp van de subsetvalidatieanalyse. De partiële correlatiecoëfficiënt (Pearson's en Spearman's correlatie) zal worden gebruikt voor de Raman-correlatie met de klinische parameter (bijv. COVID-19 klinisch verloop) die als controle gebruikt worden, varieert de leeftijd en het geslacht van de proefpersonen. Het classificatiemodel zal vervolgens worden vertaald en gebruikt als zorgpunt met behulp van een draagbare Raman die is uitgerust met een laser die uitzendt op 785 nm, met een vergelijkbare spectrale resolutie.

• MONSTERVERZAMELING: Speeksel wordt verzameld met Salivette (SARSTEDT, Duitsland), volgens de instructies van de fabrikant. Het wattenstaafje wordt in de mond van de patiënt gestoken en gedurende 60 seconden gekauwd. De speekselverzameling wordt bereikt door centrifugeren van het wattenstaafje (1000 g x 2 min), waarbij alle gerelateerde parameters worden geregistreerd (opslagtemperatuur en de tijd tussen verzameling en analyse). Alle ophaalprocedures worden ten minste twee uur na de laatste maaltijd en tandenpoetsen uitgevoerd.
• MONSTERVERWERKING: Vóór de analyse wordt speeksel (3 µl) op aluminiumfolie gedeponeerd en een nacht gedroogd. De aluminiumfolie is van fundamenteel belang om de Surface Enhanced Raman Scattering te bereiken, waardoor het speeksel Raman-signaal toeneemt.
• GEGEVENSVERZAMELING: Raman-spectra zullen worden verkregen met behulp van een Aramis Raman-microscoop (Horiba Jobin-Yvon, Frankrijk) uitgerust met een laserlichtbron die werkt op 785 nm met 100% (512 mW) laservermogen. De acquisitietijd wordt ingesteld op 30 seconden met dubbele acquisitie en 2 seconden vertragingstijd om de vorming van artefactspectra te voorkomen. Voor elke analyse wordt het instrument gekalibreerd met behulp van de referentieband van silicium. Alle signalen zullen worden verkregen in het gebied tussen 400 en 1600 cm-1 met een resolutie van 0,8 cm-1, waarbij ten minste 25 spectra worden verkregen volgens een vierkante kaart. Het softwarepakket LabSpec 6 (Horiba Jobin-Yvon) zal worden gebruikt voor kaartontwerp en het verzamelen van spectra.
• GEGEVENSANALYSE: Alle gegevens worden aangepast met behulp van een polynoomcurve van de vierde graad om de basislijn in te stellen en vervolgens genormaliseerd met behulp van een eenheidsvector. De bijdrage van aluminium wordt uit elk spectrum verwijderd. De statistische analyse zal worden uitgevoerd met behulp van de multivariate benadering. In het kort zullen hoofdcomponentenanalyse en lineaire discriminantanalyse worden toegepast om de hoofdcomponenten en de canonieke variabelen te extraheren. Deze kenmerken zullen worden gebruikt voor de 'leave one out' kruisvalidatie (LOOCV), subsetvalidatie en correlatie met de klinische parameters. Mann-Whitney zal worden uitgevoerd op pc-scores om de statistisch relevante verschillen tussen de geanalyseerde groepen te verifiëren. De analyse wordt uitgevoerd met behulp van Origin-software (OriginLab, VS).
• CORRELATIE: Gedeeltelijke correlatie met de coëfficiënten van Pearson en Spearman zal worden uitgevoerd op de geëxtraheerde variabelen en de klinische parameters, waarbij de leeftijd en het geslacht van de proefpersonen als controlevariabelen worden gebruikt. Alleen waarden met p < 0,001 worden als statistisch relevant beschouwd.
• VERTALING: De gegevens en het classificatiemodel zullen worden toegepast met een draagbare Raman die is uitgerust met een laser die uitzendt op 785 nm en met een spectrale resolutie die vergelijkbaar is met die van de vorige analyse.