Der Speichel-Raman-COVID-19-Fingerabdruck

HINTERGRUND/BEGRÜNDUNG: Der Ausbruch der Coronavirus-Krankheit 2019 (COVID-19), verursacht durch eine Infektion mit SARS-CoV-2, hat sich schnell zu einer weltweiten Pandemie ausgebreitet. Die globale Forschung konzentrierte sich auf das Verständnis des biochemischen Infektionsmechanismus und auf die Entdeckung eines schnellen, empfindlichen und kostengünstigen Diagnoseinstruments, das in der Lage ist, aktuelle und frühere SARS-CoV-2-Infektionen anhand einer minimalinvasiven Bioflüssigkeit zu unterscheiden. Die schnelle Diagnose von COVID-19 ist von grundlegender Bedeutung, um die positiven Fälle zu begrenzen und zu isolieren und mit einem sofortigen Eingriff die Ausbreitung der Infektion zu verringern. Darüber hinaus könnte die Vorhersage der Schwere der Atemwegsinfektion von entscheidender Bedeutung für die schnelle Identifizierung und Unterscheidung zwischen mildem Krankheitsverlauf, schwerer Erkrankung und akutem Atemnotsyndrom (ARDS) sein. Einer der ersten Infektionsorte von SARS-CoV-2 ist die Mundhöhle, wo das Virus an die auf den Epithelzellen der Speicheldrüsen vorhandenen ACE2-Rezeptoren binden und eindringen kann. So konnte in den Vorstufen der Infektion eine hohe Konzentration an Viruspartikeln im Speichel nachgewiesen werden. Speichel ist eine komplexe Bioflüssigkeit, die aus bioaktiven Molekülen besteht, die mit einem wirklich minimal-invasiven Verfahren gesammelt werden können. Die Raman-Spektroskopie ist eine nicht-invasive, schnelle und markierungsfreie Vibrationstechnik, die Informationen über Anwesenheit, Konzentration, Umgebung, Modifikationen und Wechselwirkungen aller in einer bestimmten Bioflüssigkeit vorhandenen biochemischen Spezies liefern kann. Mithilfe der Raman-Spektroskopie werden die Forscher Speichel analysieren, der von gesunden Probanden, von COVID-19 betroffenen Patienten und Probanden mit einer früheren Infektion mit COVID-19 gesammelt wurde. Die gesammelten Daten werden analysiert und verwendet, um eine Raman-Datenbank zu erstellen, die in der Lage ist, ein auf maschinellem Lernen basierendes Klassifizierungsmodell bereitzustellen. Die Möglichkeit, einen potenziellen Speichel-COVID-19-Fingerabdruck zu überwachen und zu charakterisieren, könnte von entscheidender Bedeutung für die Überwachung und Unterscheidung von COVID-19-Probanden mit einer aktuellen und vergangenen Infektion von den gesunden Probanden sein.

ZIELE: Ziel des Projekts ist es, den Raman-Fingerabdruck von COVID-19 im Speichel zu charakterisieren und zu validieren und die wichtigsten Biomoleküle zu verstehen, die an den Unterschieden zwischen den drei Versuchsgruppen beteiligt sind: 1) gesunde Probanden, 2) COVID-19-Patienten und 3) Probanden mit einer früheren Infektion mit COVID-19. Die große Menge an Raman-Daten wird verwendet, um eine Speichel-Raman-Datenbank zu erstellen, wobei alle Daten mit den entsprechenden gesammelten klinischen Daten verknüpft werden. Die Raman-Datenbank wird für die Erstellung eines Klassifikationsmodells durch die Anwendung multivariater Analyse in Form von Hauptkomponentenanalyse und linearer Diskriminanzanalyse verwendet. Dieses Klassifizierungsmodell wird ein schnelles Werkzeug zur Unterscheidung des COVID-19-Zustands bereitstellen und möglicherweise auch Informationen über den respiratorischen klinischen Verlauf des Patienten liefern. Das Modell wird für die Anwendung auf einem tragbaren Raman-Spektrometer übersetzt, was zur Schaffung eines Raman Point of Care führt. METHODEN: Ausgehend von den vorläufigen Ergebnissen und Protokollen des Labors für Nanomedizin und klinische Biophotonik (LABION) - IRCCS Fondazione Don Gnocchi Milano wird der von jeder Versuchsgruppe gesammelte Speichel mittels Raman-Spektroskopie analysiert. Alle Daten werden für die Basislinie, Verschiebung und Normalisierung verarbeitet, um die gesammelten Signale zu homogenisieren und auf diese Weise die Raman-Datenbank zu erstellen. Das aus jeder Gruppe berechnete Durchschnittsspektrum wird charakterisiert, wobei die Hauptfamilien biologischer Moleküle identifiziert werden, die für die spektralen Unterschiede verantwortlich sind. Anschließend werden alle Spektren durch multivariate Analyse (Hauptkomponentenanalyse und lineare Diskriminanzanalyse) verarbeitet, um auf diese Weise das Klassifikationsmodell zu erhalten. LOOCV wird für das Training des Klassifikationsmodells verwendet, das anhand der Subset-Validierungsanalyse hinterfragt wird. Der partielle Korrelationskoeffizient (Korrelation nach Pearson und Spearman) wird für die Raman-Korrelation mit dem klinischen Parameter (z. B. Klinischer COVID-19-Kurs) unter Verwendung von Kovariaten Alter und Geschlecht der Probanden als Kontrolle. Das Klassifizierungsmodell wird dann übersetzt und mit einem tragbaren Raman, der mit einem bei 785 nm emittierenden Laser mit vergleichbarer spektraler Auflösung ausgestattet ist, als Point-of-Care verwendet.

• PROBENENTNAHME: Speichel wird mit Salivette (SARSTEDT, Deutschland) gemäß den Anweisungen des Herstellers gesammelt. Der Wattestäbchen wird in den Mund des Probanden eingeführt und 60 Sekunden lang gekaut. Die Speichelsammlung erfolgt durch Zentrifugation des Tupfers (1000 g x 2 min), wobei alle damit verbundenen Parameter (Lagertemperatur und die Zeit zwischen Sammlung und Analyse) aufgezeichnet werden. Alle Entnahmeverfahren werden mindestens zwei Stunden nach der letzten Mahlzeit und dem letzten Zähneputzen durchgeführt.
• PROBENAUFBEREITUNG: Speichel (3 ul) wird vor der Analyse auf Alufolie aufgetragen und über Nacht getrocknet. Die Aluminiumfolie ist von grundlegender Bedeutung, um die oberflächenverstärkte Raman-Streuung zu erreichen und das Speichel-Raman-Signal zu erhöhen.
• DATENSAMMLUNG: Raman-Spektren werden unter Verwendung eines Aramis-Raman-Mikroskops (Horiba Jobin-Yvon, Frankreich) erfasst, das mit einer Laserlichtquelle ausgestattet ist, die bei 785 nm mit 100 % (512 mW) Laserleistung arbeitet. Die Aufnahmezeit wird auf 30 Sekunden mit doppelter Aufnahme und 2 Sekunden Verzögerungszeit eingestellt, um die Bildung von Artefaktspektren zu verhindern. Vor jeder Analyse wird das Gerät mit dem Referenzband aus Silizium kalibriert. Alle Signale werden im Bereich zwischen 400 und 1600 cm-1 mit einer Auflösung von 0,8 cm-1 erfasst, wobei mindestens 25 Spektren nach einer quadratischen Karte erfasst werden. Für das Kartendesign und die Aufnahme von Spektren wird das Softwarepaket LabSpec 6 (Horiba Jobin-Yvon) verwendet.
• DATENANALYSE: Alle Daten werden unter Verwendung einer Polynomkurve vierten Grades angepasst, um die Grundlinie festzulegen, und anschließend unter Verwendung des Einheitsvektors normalisiert. Der Beitrag von Aluminium wird aus jedem Spektrum entfernt. Die statistische Auswertung erfolgt nach dem multivariaten Ansatz. Kurz gesagt werden Hauptkomponentenanalyse und lineare Diskriminanzanalyse angewendet, um die Hauptkomponenten und die kanonischen Variablen zu extrahieren. Diese Merkmale werden für die Auslassungs-Kreuzvalidierung (LOOCV), die Untergruppenvalidierung und die Korrelation mit den klinischen Parametern verwendet. Mann-Whitney wird an PC-Scores durchgeführt, um die statistisch relevanten Unterschiede zwischen den analysierten Gruppen zu überprüfen. Die Analyse wird mit der Origin-Software (OriginLab, USA) durchgeführt.
• KORRELATION: An den extrahierten Variablen und den klinischen Parametern wird eine partielle Korrelation mit Pearson- und Spearman-Koeffizienten durchgeführt, wobei Alter und Geschlecht der Probanden als Kontroll-Kovariaten verwendet werden. Nur Werte mit p < 0,001 werden als statistisch relevant betrachtet.
• ÜBERSETZUNG: Die Daten und das Klassifizierungsmodell werden mit einem tragbaren Raman angewendet, der mit einem Laser ausgestattet ist, der bei 785 nm emittiert und eine spektrale Auflösung aufweist, die mit der für die vorherige Analyse verwendeten vergleichbar ist.