Spytt Raman COVID-19-fingeravtrykket

BAKGRUNN/RASJONAL: Utbruddet av koronavirussykdom 2019 (COVID-19), forårsaket av infeksjon av SARS-CoV-2, har raskt spredt seg til å bli en verdensomspennende pandemi. Global forskning fokuserte på forståelsen av den biokjemiske infeksjonsmekanismen og på oppdagelsen av et raskt, sensitivt og billig diagnostisk verktøy som er i stand til å diskriminere nåværende og tidligere SARS-CoV-2-infeksjoner fra en minimal invasiv biovæske. Den raske diagnosen av COVID-19 er grunnleggende for å begrense og isolere de positive tilfellene, og redusere infeksjonen med et raskt inngrep. Dessuten kan forutsigelsen av alvorlighetsgraden av luftveisinfeksjonen være av avgjørende betydning for rask identifisering og diskriminering mellom mildt klinisk forløp, alvorlig sykdom og akutt respiratorisk distresssyndrom (ARDS). Et av de første infeksjonsstedene til SARS-CoV-2 er munnhulen der viruset er i stand til å binde seg og trenge gjennom ACE2-reseptorene som finnes på epitelcellene i spyttkjertlene. Dermed kunne en høy konsentrasjon av viruspartikler finnes i spytt i de innledende fasene av infeksjonen. Spytt er en kompleks biovæske som består av bioaktive molekyler som kan samles opp med en virkelig minimal-invasiv prosedyre. Raman-spektroskopi er en ikke-invasiv, rask og merkefri vibrasjonsteknikk, i stand til å gi informasjon om tilstedeværelse, konsentrasjon, miljø, modifikasjoner og interaksjoner av alle de biokjemiske artene som finnes i en spesifikk biovæske. Ved å bruke Raman-spektroskopien vil forskerne analysere spytt samlet inn fra friske forsøkspersoner, pasienter som er rammet av COVID-19 og forsøkspersoner med en tidligere infeksjon av COVID-19. Dataene som samles inn vil bli analysert og brukt til å lage en Raman-database som kan gi en klassifiseringsmodell basert på maskinlæring. Muligheten til å overvåke og karakterisere et potensielt spytt-covid-19-fingeravtrykk kan være av avgjørende betydning for overvåking og diskriminering av covid-19-personer med nåværende og tidligere infeksjon fra friske forsøkspersoner.

MÅL: Målet med prosjektet er å karakterisere og validere spytt-Raman-fingeravtrykket til COVID-19, og forstå de viktigste biomolekylene som er involvert i forskjellene mellom de tre eksperimentelle gruppene: 1) friske forsøkspersoner, 2) COVID-19-pasienter og 3) forsøkspersoner med en tidligere infeksjon av covid-19. Den store mengden Raman-data vil bli brukt til å lage en Raman-database for spytt, som knytter hver data til de relative kliniske dataene som samles inn. Raman-databasen vil bli brukt til å lage en klassifikasjonsmodell gjennom bruk av multivariat analyse i form av hovedkomponentanalyse og lineær diskriminantanalyse. Denne klassifiseringsmodellen vil gi et raskt verktøy for diskriminering av COVID-19-tilstanden, og potensielt også gi informasjon om det respiratoriske kliniske forløpet til pasienten. Modellen vil bli oversatt for applikasjonen til et bærbart Raman-spektrometer, noe som fører til opprettelsen av et Raman Point of Care-METODER: Med utgangspunkt i de foreløpige resultatene og protokollene til Laboratory of Nanomedicine and Clinical Biophotonics (LABION) - IRCCS Fondazione Don Gnocchi Milano , vil spyttet samlet fra hver eksperimentelle gruppe bli analysert ved bruk av Raman-spektroskopi. Alle dataene vil bli behandlet for baseline, skift og normalisering for å homogenisere signalene som samles inn og på denne måten skape Raman-databasen. Gjennomsnittsspekteret beregnet fra hver gruppe vil bli karakterisert, og identifisere hovedfamiliene av biologiske molekyler som er ansvarlige for de spektrale forskjellene. Fortløpende vil alle spektrene bli behandlet gjennom multivariat analyse (hovedkomponentanalyse og lineær diskriminantanalyse) for å oppnå klassifikasjonsmodellen på denne måten. LOOCV vil bli brukt til opplæring av klassifiseringsmodellen, som vil bli stilt spørsmål ved ved hjelp av delsettvalideringsanalysen. Den partielle korrelasjonskoeffisienten (Pearsons og Spearmans korrelasjon) vil bli brukt for Raman-korrelasjonen med den kliniske parameteren (f.eks. COVID-19 klinisk forløp) ved å bruke som kontroll samvarierer alderen og kjønnet til forsøkspersonene. Klassifiseringsmodellen vil deretter bli oversatt og brukt som behandlingspunkt ved bruk av en bærbar Raman utstyrt med en laser som sender ut ved 785 nm, med en sammenlignbar spektral oppløsning.

• PRØVEINNSAMLING: Spytt vil bli samlet med Salivette (SARSTEDT, Tyskland), etter produsentens instruksjoner. Bomullspinnen settes inn i personens munn og tygges i 60 sekunder. Spyttoppsamlingen vil bli oppnådd gjennom sentrifugering av vattpinne (1000 g x 2 min), registrering av alle relaterte parametere (lagringstemperatur og tiden mellom oppsamling og analyse). Alle innsamlingsprosedyrene vil bli utført minst to timer etter siste måltid og tannpuss.
• PRØVEBEHANDLING: Før analysen vil spytt (3 ul) avsettes på aluminiumsfolie og tørkes over natten. Aluminiumsfolien er grunnleggende for å oppnå overflateforbedret Raman-spredning, som øker spytt-raman-signalet.
• DATAINNSAMLING: Raman-spektra vil bli innhentet ved hjelp av et Aramis Raman-mikroskop (Horiba Jobin-Yvon, Frankrike) utstyrt med en laserlyskilde som opererer ved 785 nm med 100 % (512mW) lasereffekt. Innsamlingstid vil bli satt til 30 sekunder med dobbel innsamling og 2 sekunders forsinkelsestid for å forhindre dannelse av artefaktspektre. Før hver analyse vil instrumentet bli kalibrert ved hjelp av referansebåndet av silisium. Alle signalene vil bli innhentet i området mellom 400 og 1600 cm-1 med en oppløsning på 0,8 cm-1, og mottar minst 25 spektre etter et kvadratisk kart. Programvarepakken LabSpec 6 (Horiba Jobin-Yvon) skal brukes til kartdesign og innhenting av spektre.
• DATAANALYSE: Alle data vil tilpasses ved å bruke en fjerdegrads polynomkurve for å sette grunnlinjen og fortløpende normaliseres ved bruk av enhetsvektor. Bidraget fra aluminium vil bli fjernet fra hvert spekter. Den statistiske analysen vil bli utført ved bruk av den multivariate tilnærmingen. Kort fortalt vil hovedkomponentanalyse og lineær diskriminantanalyse bli brukt for å trekke ut hovedkomponentene og de kanoniske variablene. Disse funksjonene vil bli brukt for å utelate kryssvalidering (LOOCV), undergruppevalidering og korrelasjon med de kliniske parameterne. Mann-Whitney vil bli utført på PC-score for å verifisere forskjellene statistisk relevante mellom de analyserte gruppene. Analysen vil bli utført med Origin-programvare (OriginLab, USA)
• KORRELASJON: Delvis korrelasjon med Pearsons og Spearmans koeffisienter vil bli utført på de ekstraherte variablene og de kliniske parametrene, ved å bruke som kontrollkovariater alderen og kjønnet til forsøkspersonene. Kun verdier med p < 0,001 vil bli vurdert som statistisk relevante.
• OVERSETTELSE: Dataene og klassifiseringsmodellen vil bli brukt med en bærbar Raman utstyrt med en laser som sender ut ved 785 nm og med en spektral oppløsning som kan sammenlignes med den som ble brukt for forrige analyse.