L'impronta digitale salivare Raman COVID-19

BACKGROUND/RAZIONALE: Lo scoppio della malattia da coronavirus 2019 (COVID-19), causato dall'infezione da SARS-CoV-2, si è rapidamente diffuso fino a diventare una pandemia mondiale. La ricerca globale si è concentrata sulla comprensione del meccanismo infettivo biochimico e sulla scoperta di uno strumento diagnostico veloce, sensibile ed economico, in grado di discriminare le infezioni attuali e passate da SARS-CoV-2 da un biofluido minimamente invasivo. La rapida diagnosi di COVID-19 è fondamentale per limitare e isolare i casi positivi, diminuendo con un tempestivo intervento la diffusione dell'infezione. Inoltre, la previsione della gravità dell'infezione respiratoria potrebbe essere di cruciale importanza per la rapida identificazione e discriminazione tra decorso clinico lieve, malattia grave e sindrome da distress respiratorio acuto (ARDS). Uno dei primi siti di infezione da SARS-CoV-2 è il cavo orale dove il virus è in grado di legarsi e penetrare attraverso i recettori ACE2 presenti sulle cellule epiteliali delle ghiandole salivari. Pertanto, un'elevata concentrazione di particelle virali potrebbe essere trovata nella saliva nelle fasi preliminari dell'infezione. La saliva è un biofluido complesso composto da molecole bioattive che possono essere raccolte con una procedura davvero minimamente invasiva. La spettroscopia Raman è una tecnica vibrazionale non invasiva, veloce e label-free, in grado di fornire informazioni su presenza, concentrazione, ambiente, modificazioni e interazioni di tutte le specie biochimiche presenti in uno specifico biofluido. Utilizzando la spettroscopia Raman, gli investigatori analizzeranno la saliva raccolta da soggetti sani, pazienti affetti da COVID-19 e soggetti con un'infezione pregressa da COVID-19. I dati raccolti verranno analizzati e utilizzati per creare un database Raman in grado di fornire un modello di classificazione basato sul machine learning. La possibilità di monitorare e caratterizzare una potenziale impronta salivare COVID-19 potrebbe essere di cruciale importanza per il monitoraggio e la discriminazione dei soggetti COVID-19 con un'infezione attuale e pregressa dai soggetti sani.

OBIETTIVI: Lo scopo del progetto è quello di caratterizzare e validare l'impronta Raman salivare di COVID-19, comprendendo le principali biomolecole coinvolte nelle differenze tra i tre gruppi sperimentali: 1) soggetti sani, 2) pazienti affetti da COVID-19 e 3) soggetti con una pregressa infezione da COVID-19. La grande quantità di dati Raman sarà utilizzata per creare un database Raman salivare, associando ciascun dato con i relativi dati clinici raccolti. Il database Raman sarà utilizzato per la creazione di un modello di classificazione attraverso l'applicazione dell'analisi multivariata in termini di analisi delle componenti principali e analisi discriminante lineare. Questo modello di classificazione fornirà uno strumento rapido per la discriminazione della condizione COVID-19, fornendo potenzialmente anche informazioni sul decorso clinico respiratorio del paziente. Il modello sarà tradotto per l'applicazione ad uno spettrometro Raman portatile, portando alla creazione di un Raman Point of Care METODI: Partendo dai risultati preliminari e dai protocolli del Laboratorio di Nanomedicina e Biofotonica Clinica (LABION) - IRCCS Fondazione Don Gnocchi Milano , la saliva raccolta da ciascun gruppo sperimentale sarà analizzata mediante spettroscopia Raman. Tutti i dati verranno elaborati per la baseline, lo shift e la normalizzazione al fine di omogeneizzare i segnali raccolti e creare così il database Raman. Lo spettro medio calcolato da ciascun gruppo sarà caratterizzato, individuando le principali famiglie di molecole biologiche responsabili delle differenze spettrali. Successivamente, tutti gli spettri saranno elaborati mediante analisi multivariata (analisi delle componenti principali e analisi discriminante lineare) ottenendo così il modello di classificazione. LOOCV sarà utilizzato per l'addestramento del modello di classificazione, che sarà interrogato utilizzando l'analisi di validazione del sottoinsieme. Il coefficiente di correlazione parziale (correlazione di Pearson e Spearman) sarà utilizzato per la correlazione Raman con il parametro clinico (es. decorso clinico COVID-19) utilizzando come covarianti di controllo l'età e il sesso dei soggetti. Il modello di classificazione sarà poi tradotto e utilizzato come point of care utilizzando un Raman portatile dotato di un laser che emette a 785 nm, con una risoluzione spettrale comparabile.

• RACCOLTA DEL CAMPIONE: La saliva verrà raccolta con Salivette (SARSTEDT, Germania), seguendo le istruzioni del produttore. Il tampone di cotone verrà inserito nella bocca del soggetto e masticato per 60 secondi. La raccolta della saliva sarà ottenuta mediante centrifugazione del tampone (1000 g x 2 min), registrando tutti i relativi parametri (temperatura di conservazione e tempo tra la raccolta e l'analisi). Tutte le procedure di raccolta verranno eseguite almeno due ore dopo l'ultimo pasto e la spazzolatura dei denti.
• PROCEDURA DEL CAMPIONE: Prima dell'analisi, la saliva (3 ul) verrà depositata su un foglio di alluminio e asciugata durante la notte. Il foglio di alluminio è fondamentale per ottenere il Surface Enhanced Raman Scattering, aumentando il segnale Raman della saliva.
• RACCOLTA DATI: Gli spettri Raman saranno acquisiti utilizzando un microscopio Aramis Raman (Horiba Jobin-Yvon, Francia) dotato di una sorgente di luce laser operante a 785 nm con potenza laser del 100% (512 mW). Il tempo di acquisizione sarà fissato a 30 secondi con doppia acquisizione e ritardo di 2 secondi per prevenire la formazione di spettri di artefatti. Prima di ogni analisi, lo strumento verrà calibrato utilizzando la banda di riferimento del silicio. Tutti i segnali saranno acquisiti nella regione tra 400 e 1600 cm-1 con una risoluzione di 0.8cm-1, acquisendo almeno 25 spettri seguendo una mappa quadrata. Il pacchetto software LabSpec 6 (Horiba Jobin-Yvon) verrà utilizzato per la progettazione di mappe e l'acquisizione di spettri.
• ANALISI DEI DATI: Tutti i dati saranno adattati utilizzando una curva polinomiale di quarto grado per impostare la linea di base e consecutivamente normalizzati utilizzando il vettore unitario. Il contributo dell'alluminio sarà rimosso da ogni spettro. L'analisi statistica sarà effettuata utilizzando l'approccio multivariato. In breve, l'analisi delle componenti principali e l'analisi discriminante lineare saranno applicate per estrarre le componenti principali e le variabili canoniche. Queste funzionalità saranno utilizzate per la validazione incrociata leave one out (LOOCV), la validazione di sottoinsiemi e la correlazione con i parametri clinici. Mann-Whitney verrà eseguito sui punteggi dei PC per verificare le differenze statisticamente rilevanti tra i gruppi analizzati. L'analisi verrà eseguita utilizzando il software Origin (OriginLab, USA)
• CORRELAZIONE: Verrà effettuata una correlazione parziale con i coefficienti di Pearson e Spearman sulle variabili estratte e sui parametri clinici, utilizzando come covariate di controllo l'età e il sesso dei soggetti. Solo i valori con p < 0.001 saranno considerati statisticamente rilevanti.
• TRADUZIONE: I dati e il modello di classificazione saranno applicati con un Raman portatile equipaggiato con un laser che emette a 785 nm e con una risoluzione spettrale paragonabile a quella utilizzata per l'analisi precedente.