Слюнный рамановский отпечаток пальца COVID-19

ПРЕДПОСЫЛКИ/ОБОСНОВАНИЕ: Вспышка коронавирусной болезни 2019 года (COVID-19), вызванная инфекцией SARS-CoV-2, быстро распространилась и приобрела характер всемирной пандемии. Глобальные исследования были сосредоточены на понимании биохимического инфекционного механизма и на открытии быстрого, чувствительного и дешевого диагностического инструмента, способного отличать текущую и прошлую инфекцию SARS-CoV-2 от минимально инвазивной биологической жидкости. Быстрая диагностика COVID-19 имеет основополагающее значение для ограничения и изоляции положительных случаев, уменьшая при оперативном вмешательстве распространение инфекции. Кроме того, прогнозирование тяжести респираторной инфекции может иметь решающее значение для быстрой идентификации и различения между легким клиническим течением, тяжелым течением заболевания и острым респираторным дистресс-синдромом (ОРДС). Одним из первых мест заражения SARS-CoV-2 является полость рта, где вирус способен связываться и проникать через рецепторы ACE2, присутствующие на эпителиальных клетках слюнных желез. Таким образом, в предварительных фазах инфекции в слюне можно было обнаружить высокую концентрацию вирусных частиц. Слюна представляет собой сложную биожидкость, состоящую из биоактивных молекул, которую можно собрать с помощью минимально инвазивной процедуры. Спектроскопия комбинационного рассеяния — это неинвазивный, быстрый и не содержащий меток вибрационный метод, способный предоставить информацию о присутствии, концентрации, окружающей среде, модификациях и взаимодействиях всех биохимических видов, присутствующих в конкретной биологической жидкости. Используя спектроскопию комбинационного рассеяния, исследователи проанализируют слюну, собранную у здоровых людей, пациентов, пострадавших от COVID-19, и лиц, перенесших инфекцию COVID-19 в прошлом. Собранные данные будут проанализированы и использованы для создания базы данных Рамана, способной предоставить модель классификации на основе машинного обучения. Возможность отслеживать и характеризовать потенциальный отпечаток пальца слюны COVID-19 может иметь решающее значение для мониторинга и различения субъектов COVID-19 с текущей и прошлой инфекцией от здоровых субъектов.

ЦЕЛИ: Цель проекта состоит в том, чтобы охарактеризовать и подтвердить рамановский отпечаток слюны COVID-19, понять основные биомолекулы, участвующие в различиях между тремя экспериментальными группами: 1) здоровые субъекты, 2) пациенты с COVID-19 и 3) субъекты. с перенесенной инфекцией COVID-19. Большой объем рамановских данных будет использоваться для создания базы данных рамановских исследований слюны, связывая каждую информацию с собранными относительными клиническими данными. База данных Рамана будет использоваться для создания модели классификации путем применения многомерного анализа с точки зрения анализа основных компонентов и линейного дискриминантного анализа. Эта классификационная модель предоставит быстрый инструмент для различения состояния COVID-19, потенциально также предоставляя информацию о клиническом течении респираторного заболевания пациента. Модель будет переведена для применения в портативном рамановском спектрометре, что приведет к созданию рамановского пункта оказания медицинской помощи МЕТОДЫ: Начиная с предварительных результатов и протоколов Лаборатории наномедицины и клинической биофотоники (LABION) - IRCCS Fondazione Don Gnocchi Milano , слюна, собранная от каждой экспериментальной группы, будет проанализирована с использованием рамановской спектроскопии. Все данные будут обработаны для базовой линии, сдвига и нормализации, чтобы гомогенизировать собранные сигналы и создать таким образом базу данных КР. Средний спектр, рассчитанный для каждой группы, будет охарактеризован с указанием основных семейств биологических молекул, ответственных за спектральные различия. Последовательно все спектры будут обработаны с помощью многофакторного анализа (анализ главных компонент и линейный дискриминантный анализ), получив таким образом классификационную модель. LOOCV будет использоваться для обучения модели классификации, которая будет подвергаться сомнению с помощью анализа проверки подмножества. Коэффициент частичной корреляции (корреляция Пирсона и Спирмена) будет использоваться для рамановской корреляции с клиническим параметром (например, Клиническое течение COVID-19) с использованием в качестве контроля ковариаций возраста и пола субъектов. Затем классификационная модель будет переведена и использована в качестве пункта оказания медицинской помощи с использованием портативного рамановского прибора, оснащенного лазером с длиной волны 785 нм и сопоставимым спектральным разрешением.

• СБОР ПРОБ: Слюна будет собираться с помощью Salivette (SARSTEDT, Германия) в соответствии с инструкциями производителя. Ватный тампон вставляют в рот испытуемому и разжевывают в течение 60 секунд. Сбор слюны будет осуществляться путем центрифугирования тампона (1000 г x 2 мин) с регистрацией всех соответствующих параметров (температура хранения и время между сбором и анализом). Все процедуры по сбору будут производиться не менее чем через два часа после последнего приема пищи и чистки зубов.
• ОБРАБОТКА ОБРАЗЦА: Перед анализом слюна (3 мкл) наносится на алюминиевую фольгу и сушится в течение ночи. Алюминиевая фольга имеет основополагающее значение для достижения поверхностного усиленного комбинационного рассеяния, увеличивая сигнал комбинационного рассеяния слюны.
• СБОР ДАННЫХ: Спектры комбинационного рассеяния света будут получены с использованием рамановского микроскопа Aramis (Horiba Jobin-Yvon, Франция), оснащенного лазерным источником света, работающим на длине волны 785 нм со 100% (512 мВт) мощностью лазера. Время сбора данных будет установлено на 30 секунд при двойном сборе данных и 2-секундной задержке для предотвращения образования спектров артефактов. Перед каждым анализом прибор будет откалиброван с использованием эталонной полосы кремния. Все сигналы будут получены в диапазоне от 400 до 1600 см-1 с разрешением 0,8 см-1, при этом будет получено не менее 25 спектров по квадратной карте. Программный пакет LabSpec 6 (Horiba Jobin-Yvon) будет использоваться для составления карт и получения спектров.
• АНАЛИЗ ДАННЫХ: Все данные будут подогнаны с использованием полиномиальной кривой четвертой степени для установки базовой линии и последовательно нормализованы с использованием единичного вектора. Вклад алюминия будет удален из каждого спектра. Статистический анализ будет проводиться с использованием многофакторного подхода. Вкратце, для извлечения главных компонент и канонических переменных будут применяться анализ главных компонент и линейный дискриминантный анализ. Эти функции будут использоваться для перекрестной проверки с исключением одного (LOOCV), проверки подмножества и корреляции с клиническими параметрами. Манн-Уитни будет выполняться по баллам ПК, чтобы проверить статистически значимые различия между анализируемыми группами. Анализ будет проводиться с использованием программного обеспечения Origin (OriginLab, США).
• КОРРЕЛЯЦИЯ: Частичная корреляция с коэффициентами Пирсона и Спирмена будет выполняться на извлеченных переменных и клинических параметрах, используя в качестве контроля ковариаты возраста и пола субъектов. Только значения с p < 0,001 будут считаться статистически значимыми.
• ПЕРЕВОД: Данные и модель классификации будут применяться с помощью портативного рамановского прибора, оснащенного лазером с длиной волны 785 нм и спектральным разрешением, сравнимым с тем, что использовался для предыдущего анализа.