Spyt Raman COVID-19 fingeraftryk

BAGGRUND/RATIONAL: Udbruddet af coronavirus sygdom 2019 (COVID-19), forårsaget af infektion med SARS-CoV-2, har hurtigt spredt sig til at blive en verdensomspændende pandemi. Global forskning fokuserede på forståelsen af ​​den biokemiske infektionsmekanisme og på opdagelsen af ​​et hurtigt, følsomt og billigt diagnostisk værktøj, der er i stand til at skelne de nuværende og tidligere SARS-CoV-2-infektioner fra en minimalt invasiv biovæske. Den hurtige diagnose af COVID-19 er fundamental for at begrænse og isolere de positive tilfælde, idet infektionen spredes med et hurtigt indgreb. Desuden kan forudsigelsen af ​​luftvejsinfektionens sværhedsgrad være af afgørende betydning for hurtig identifikation og skelnen mellem mildt klinisk forløb, svær sygdom og akut respiratorisk distresssyndrom (ARDS). Et af de første infektionssteder for SARS-CoV-2 er mundhulen, hvor virussen er i stand til at binde og trænge gennem ACE2-receptorerne på spytkirtlernes epitelceller. Der kunne således findes en høj koncentration af viruspartikler i spyt i de indledende faser af infektionen. Spyt er en kompleks biovæske sammensat af bioaktive molekyler, der kan opsamles med en virkelig minimal-invasiv procedure. Raman-spektroskopi er en ikke-invasiv, hurtig og etiketfri vibrationsteknik, der er i stand til at give information om tilstedeværelse, koncentration, miljø, modifikationer og interaktioner af alle de biokemiske arter, der er til stede i en specifik biovæske. Ved hjælp af Raman-spektroskopien vil forskerne analysere spyt indsamlet fra raske forsøgspersoner, patienter ramt af COVID-19 og forsøgspersoner med en tidligere infektion med COVID-19. De indsamlede data vil blive analyseret og brugt til at skabe en Raman-database, der kan levere en klassifikationsmodel baseret på maskinlæring. Muligheden for at overvåge og karakterisere et potentielt spyt COVID-19-fingeraftryk kan være af afgørende betydning for overvågning og diskrimination af COVID-19-personer med en nuværende og tidligere infektion fra de raske forsøgspersoner.

MÅL: Formålet med projektet er at karakterisere og validere spyt-Raman-fingeraftrykket af COVID-19, forstå de vigtigste biomolekyler involveret i forskellene mellem de tre forsøgsgrupper: 1) raske forsøgspersoner, 2) COVID-19-patienter og 3) forsøgspersoner med en tidligere infektion med COVID-19. Den store mængde Raman-data vil blive brugt til at skabe en Raman-spytdatabase, der forbinder hver data med de relative kliniske data, der er indsamlet. Raman-databasen vil blive brugt til at skabe en klassifikationsmodel gennem anvendelse af multivariat analyse i form af principal komponentanalyse og lineær diskriminantanalyse. Denne klassificeringsmodel vil give et hurtigt værktøj til diskrimination af COVID-19-tilstanden, og potentielt også give information om patientens respiratoriske kliniske forløb. Modellen vil blive oversat til applikationen til et bærbart Raman-spektrometer, hvilket fører til oprettelsen af ​​et Raman Point of Care-METODER: Med udgangspunkt i de foreløbige resultater og protokoller fra Laboratory of Nanomedicine and Clinical Biophotonics (LABION) - IRCCS Fondazione Don Gnocchi Milano , vil spyttet opsamlet fra hver forsøgsgruppe blive analyseret ved hjælp af Raman-spektroskopi. Alle data vil blive behandlet til baseline, skift og normalisering for at homogenisere de indsamlede signaler og på denne måde skabe Raman-databasen. Det gennemsnitlige spektrum beregnet fra hver gruppe vil blive karakteriseret, og identificere de vigtigste familier af biologiske molekyler, der er ansvarlige for de spektrale forskelle. Efterfølgende vil alle spektrene blive behandlet gennem multivariat analyse (hovedkomponentanalyse og lineær diskriminantanalyse), hvilket på denne måde opnår klassifikationsmodellen. LOOCV vil blive brugt til træning af klassifikationsmodellen, som der vil blive stillet spørgsmålstegn ved ved hjælp af delmængdevalideringsanalysen. Den partielle korrelationskoefficient (Pearsons og Spearmans korrelation) vil blive brugt til Raman-korrelationen med den kliniske parameter (f.eks. COVID-19 kliniske forløb) som kontrol kovarierer forsøgspersonernes alder og køn. Klassificeringsmodellen vil derefter blive oversat og brugt som et plejepunkt ved hjælp af en bærbar Raman udstyret med en laser, der udsender ved 785 nm, med en sammenlignelig spektral opløsning.

• PRØVEINDSAMLING: Spyt vil blive opsamlet med Salivette (SARSTEDT, Tyskland), efter producentens instruktioner. Vatpinden vil blive indsat i emnets mund og tygget i 60 sekunder. Spytopsamlingen vil blive opnået gennem centrifugering af podepinden (1000 g x 2 min), hvor alle de relaterede parametre (opbevaringstemperatur og tiden mellem opsamling og analyse) registreres. Alle indsamlingsprocedurer vil blive udført mindst to timer efter sidste måltid og tandbørstning.
• PRØVEBEHANDLING: Før analysen vil spyt (3 ul) blive aflejret på aluminiumsfolie og tørret natten over. Aluminiumsfolien er grundlæggende for at opnå den overfladeforbedrede Raman-spredning, hvilket øger spyt-raman-signalet.
• DATAINDSAMLING: Raman-spektre vil blive erhvervet ved hjælp af et Aramis Raman-mikroskop (Horiba Jobin-Yvon, Frankrig) udstyret med en laserlyskilde, der opererer ved 785 nm med 100 % (512mW) lasereffekt. Optagelsestid vil blive sat til 30 sekunder med dobbelt optagelse og 2 sekunders forsinkelsestid for at forhindre dannelsen af ​​artefaktspektre. Før hver analyse vil instrumentet blive kalibreret ved hjælp af referencebåndet af silicium. Alle signalerne vil blive opsamlet i området mellem 400 og 1600 cm-1 med en opløsning på 0,8 cm-1, der erhverver mindst 25 spektre efter et kvadratisk kort. Softwarepakken LabSpec 6 (Horiba Jobin-Yvon) vil blive brugt til kortdesign og erhvervelse af spektre.
• DATAANALYSE: Alle data tilpasses ved hjælp af en fjerdegrads polynomiumkurve for at indstille basislinjen og normaliseres fortløbende ved hjælp af enhedsvektor. Bidraget fra aluminium vil blive fjernet fra hvert spektrum. Den statistiske analyse vil blive udført ved hjælp af den multivariate tilgang. Kort fortalt vil hovedkomponentanalyse og lineær diskriminantanalyse blive anvendt til at udtrække hovedkomponenterne og de kanoniske variable. Disse funktioner vil blive brugt til "leave one out"-krydsvalidering (LOOCV), undergruppevalidering og korrelation med de kliniske parametre. Mann-Whitney vil blive udført på pcs score for at verificere forskellene statistisk relevante mellem de analyserede grupper. Analysen vil blive udført ved hjælp af Origin-software (OriginLab, USA)
• Korrelation: Delvis korrelation med Pearsons og Spearmans koefficienter vil blive udført på de ekstraherede variabler og de kliniske parametre, ved at bruge som kontrolkovariater forsøgspersonernes alder og køn. Kun værdier med p < 0,001 vil blive betragtet som statistisk relevante.
• OVERSÆTTELSE: Dataene og klassifikationsmodellen vil blive anvendt med en bærbar Raman udstyret med en laser, der udsender ved 785 nm og med en spektral opløsning, der kan sammenlignes med den, der blev brugt til den tidligere analyse.