小儿 IBD 的血管功能障碍

调查计划：

患者：130 名儿童和青少年 (8-21 岁)，预期比例为 60% (n=78) 克罗恩病 (CD)，35% (n=45) 溃疡性结肠炎 (UC) 5% (n=6) 不确定性结肠炎（我知道了）。 将调查 78 名年龄和性别匹配的对照。 样本量计算基于循环内皮细胞 (CEC) 作为主要终点，正如其中一位共同申请人正在进行的针对健康儿童和川崎病儿童的研究所建议的那样（Brogan P 等人，参考文献出版）。

需要 40 名受试者/组来检测 CD 和 UC 中的 CEC 与对照组相比的两倍平均值，功效为 90%，显着性为 0.05，这应该可以通过我们最初的招募来实现。 非正态性和分析前需要使用非参数或变换，将数量增加到 47；因此我们的目标是招募 50 人加入 UC 小组。 这将提供足够的功效，并且根据我们可用的临床队列是可行的。

该患者队列是本研究的合适候选组，因为

1. 有证据表明，发生在 10-20 岁之间的血管变化是未来血管系统健康的关键决定因素；
2. 吸烟习惯最有可能在青少年时期开始，并且
3. 其他既定的动脉粥样硬化传统风险因素（如高血压、II 型糖尿病，甚至完全确定的动脉粥样硬化疾病）将作为混杂变量，在青春期尚未出现。

数据将整理到去识别化的 Excel 表中，包括年龄、性别、诊断时的年龄、就诊时的冠状动脉状态、生长、体重指数、血压、CVD 家族史和吸烟状况。

目标 1：患有 IBD 的儿童是否有 MP 介导的血栓形成倾向的证据？ MP 将通过流式细胞术进行鉴定，如我们小组先前所描述的那样。 简而言之，将从血液中获取贫血小板血浆 (PPP)，并将其储存在 -80 °C 下以供将来批量测试。 200 μL 的 PPP 将允许 MPs 沉淀，在用 FITC-或藻红蛋白-AnV (BD PharMingen) 染色之前，这些 MPs 将重新悬浮在膜联蛋白 V (AnV) 结合缓冲液中。 内皮细胞、血小板和嗜中性粒细胞衍生的 MPs (EMPs/PMPs/NMPs) 和组织因子 (TF) 将通过检测抗人（CD62E、CD41 和 CD11b 激活表位，分别与激活的嗜中性粒细胞结合，加上相关的同种型对照）进行计数). 乳胶珠 (1.1 μm) 用于门控小于 1.1 μm 的 MP。 通过将 MP 悬浮在含有胰蛋白酶抑制剂 [抑制接触激活] 的对照无微粒血浆 (MPFP) 中，然后暴露于钙荧光底物 (Z-G-G-R-AMC)，可以量化 MP 的血栓形成潜力。 直到刺激后 90 分钟，都会记录凝血酶生成的动力学。 将计算滞后时间分钟、峰值凝血酶 nM、速度指数 nM/分钟和内源性凝血酶潜能 (ETP) nM × 分钟。 为了研究 PS 和 TF 对 MP 介导的凝血酶生成的相对贡献，在凝血酶分析之前，MP 将与浓度增加的重组 AnV 蛋白或阻断抗 TF（或同种型对照）一起预孵育。

目标 2. 患有 IBD 的儿童是否有内皮损伤的证据？ 除了研究动脉健康（下文），我们还将通过测量 CEC 来量化血管损伤。 CEC 将通过免疫磁珠提取（基于国际共识协议）进行分离，并使用 Nageotte 室/荧光显微镜进行计数。 CEC 计数被定义为尺寸 >10 μm 的 Ulex-europaeus-lectin 亮细胞，附有 5 个磁珠 19。 数据将在 EMP 数据（目标 1）的背景下进行分析，因为该组合将深入了解 IBD 与对照组的内皮损伤程度。

目标 3. 患有 IBD 的儿童是否有结构性动脉疾病的证据？ 脉搏波速度 (PWV) 将是动脉结构健康的指标。 使用 VICORDER 分析软件（Skidmore Medical Limited）同时记录两个部位（颈动脉-股动脉）的压力波形；

目标 4. 炎症指标与已确定的血管损伤介质之间有何关系？ hs-CRP、血清淀粉样蛋白 A (SAA)、TNF-α、IL-1α、IL-1β、IL-6、MCP-1、VEGF、空腹血脂和血管生成素 1/2 的水平将与经过验证的临床评估相关联疾病活动 [儿科 UC 活动指数 20 (PUCAI) 和儿科 CD 活动指数 (PCDAI)] 除了常规标志物（活动性和非活动性疾病中的 CRP、ESR、D-二聚体和血小板）。 在许多情况下，常规循环标志物与活动性疾病的内窥镜检查结果无关；非常规标记物在检测那些持续活跃的炎症时可能表现出更高的敏感性。

方法：

1. 临床数据收集：受试者临床数据将从试点研究中使用的纸质数据收集形式整理到去识别的 excel 电子表格中。 收集的临床数据将包括年龄、性别、IBD 诊断时的年龄、就诊时和目前的冠状动脉状态、生长和体重指数、血压、心血管疾病家族史和吸烟状况。
2. 将使用 Meso Scale Discovery（MSD，马里兰州，美国）多阵列电化学发光检测血浆来评估慢性炎症：hs-CRP、SAA、TNF-α、IL-6、8 和 10、MCP-1、VEGF、血管生成素 1和 2（后者介导系统性血管炎中的内皮脱离 (66)。 这种技术允许从非常少量的血液中测定许多参数，并且（按照制造商的说明）在试点研究中取得了巨大成功； d. 内皮激活/损伤将通过以下方式评估： CEC 计数通过使用抗 CD146 涂层珠从全血中分离的免疫磁珠 (IB) 量化，然后用 FITC 缀合的 Ulex 染色，并使用荧光显微镜和 Nageotte 计数室计数，如前所述我们的小组和其他人 (46;67)；使用 BD FACSArray 流式细胞仪，如我们小组先前所述（44 ); e.通过评估 (i) EPC 集落形成单位 (CFU) 容量 (68) 和 (ii) EPC有可能在基质胶中融入 HUVEC 血管结构 (69)，现在由我们小组常规进行（见下文）。 从分离自 5ml 血液的 PBMC 制备 EPC，将其接种到涂有人纤连蛋白的培养皿中，并维持在补充有 20% 胎牛血清和 40ng/ml VEGF 的 EGM-2 中。 培养 4 天后，通过用磷酸盐缓冲盐水洗涤去除非粘附细胞，并将粘附细胞维持在培养物中直至第 7 天。然后对早期 EPC 集落形成单位进行计数。 如上所述收获的扩增 EPC 然后用 Di -I-LDL 标记，并在凝固的基质胶层顶部用 HUVEC 重新铺板，并在 37°C 下孵育 24 小时。 荧光显微镜用于评估 EPC 并入 HUVEC 毛细管晶格，HUVEC 小管形成（结构显示长度是其宽度的四倍）将使用来自 KD (+/- CAA) 的 EPC 与健康对照进行比较。 每个孔评估五个独立视野，并确定平均小管数/×100 个视野。 F。 血管僵硬和颈动脉 IMT 将通过以下方式进行评估：正如我们的试点数据和我们之前发表的研究 (71-73) 所示，所有这些技术均由我们小组根据 AHA 推荐 (70) 常规执行。