Cévní dysfunkce u dětského IBD

Plán vyšetřování:

Pacienti: 130 dětí a dospívajících (8-21 let) s očekávaným poměrem 60 % (n=78) Crohnova nemoc (CD), 35 % (n=45) Ulcerózní kolitida (UC) 5 % (n=6) Neurčitá kolitida (IC). Bude prošetřeno 78 kontrol podle věku a pohlaví. Výpočty velikosti vzorku jsou založeny na cirkulujících endoteliálních buňkách (CEC) jako primárním cíli, jak navrhuje probíhající studie jednoho ze spolužadatelů na zdravých dětech a dětech s Kawasakiho chorobou (Brogan P et al, ref. zveřejněno).

40 subjektů/skupina je zapotřebí k detekci zdvojnásobení průměru CEC u CD a UC vs. kontrola s 90% mocí, významnost 0,05 a toho by mělo být dosaženo naším počátečním náborem. Nenormálnost a potřeba použít neparametrické nebo transformační před analýzou zvyšuje počet na 47; proto se zaměříme na nábor 50 do skupiny UC. To poskytne adekvátní výkon a je to proveditelné na základě klinické kohorty, kterou máme k dispozici.

Tato kohorta pacientů je vhodnou kandidátní skupinou pro současné vyšetřování, protože

1. Důkazy naznačují, že vaskulární změny, ke kterým dochází ve věku 10-20 let, jsou kritickým faktorem budoucího zdraví vaskulatury;
2. Začátek kouření je nejpravděpodobnější v období dospívání
3. Jiné zavedené tradiční rizikové faktory aterosklerózy (jako je hypertenze, diabetes typu II nebo dokonce plně prokázaná aterosklerotická choroba), které by působily jako matoucí proměnné, se v dospívání ještě nevyskytují.

Data budou shromážděna do deidentifikovaného excelového listu a budou zahrnovat věk, pohlaví, věk při diagnóze, stav koronární arterie při prezentaci, růst, index tělesné hmotnosti, krevní tlak, rodinnou anamnézu KVO a kouření.

Cíl 1: Mají děti s IBD známky protrombotické tendence zprostředkované MP? MP budou identifikovány průtokovou cytometrií, jak bylo dříve popsáno naší skupinou19. Stručně řečeno, plazma chudá na destičky (PPP) bude získána z krve a skladována při -80 °C pro budoucí šaržové testování. 200 μl PPP umožní sedimentaci MP, které budou resuspendovány ve vazebném pufru pro Annexin V (AnV) před barvením pomocí FITC nebo fykoerythrinu -AnV (BD PharMingen). Endoteliální, trombocytární a neutrofilní odvozené MP (EMP/PMP/NMP) a tkáňový faktor (TF) budou vyčísleny detekcí s anti-humánním (CD62E, CD41 a CD11b aktivačním epitopem, který se váže na aktivované neutrofily, v tomto pořadí, plus relevantní izotypové kontroly ). Latexové kuličky (1,1 μm) se používají k hradlování MP < 1,1 μm. Trombotický potenciál MPs bude kvantifikován suspendováním MPs v kontrolní plazmě bez mikročástic (MPFP) obsahující inhibitor trypsinu [inhibuje kontaktní aktivaci] s následnou expozicí vápníku-fluorogennímu substrátu (Z-G-G-R-AMC). Kinetika tvorby trombinu bude zaznamenávána až 90 minut po stimulaci. Bude vypočtena doba prodlevy min, vrchol trombinu nM, index rychlosti nM/min a endogenní trombinový potenciál (ETP) nM × min. Aby se prozkoumal relativní příspěvek PS a TF k tvorbě trombinu zprostředkovaného MP, budou MP před inkubací před analýzou trombinu předinkubovány se zvyšujícími se koncentracemi rekombinantního AnV proteinu nebo blokující anti-TF (nebo izotypová kontrola).

Cíl 2. Mají děti s IBD známky endoteliálního poranění? Kromě vyšetřování arteriálního zdraví (níže) budeme kvantifikovat vaskulární poškození měřením CEC. CEC budou izolovány extrakcí imunomagnetickými kuličkami (na základě mezinárodního konsenzuálního protokolu) a počítány pomocí Nageotteovy komůrky/fluorescenční mikroskopie. Výpočet CEC je definován jako světlé buňky Ulex-europaeus-lektin o velikosti > 10 μm, s 5 připojenými magnetickými kuličkami19. Data budou analyzována v kontextu dat EMP (Cíl 1), protože kombinace poskytne pohled na stupeň endoteliálního poškození u IBD oproti kontrole.

Cíl 3. Mají děti s IBD známky strukturálního arteriálního onemocnění? Pulse Wave Velocity (PWV) bude indikátorem arteriálního strukturálního zdraví. Tlakové křivky budou zaznamenávány současně na dvou místech (karotidní-femorální) pomocí analytického softwaru VICORDER (Skidmore Medical Limited);

Cíl 4. Jaký je vztah mezi indexy zánětu a zavedenými mediátory cévního poranění? Hladiny hs-CRP, sérového amyloidu A (SAA), TNF-α, IL-1α, IL-1β, IL-6, MCP-1, VEGF, lipidů nalačno a angiopoetinu 1/2 budou korelovány s validovaným klinickým hodnocením aktivita onemocnění [Pediatric UC Activity Index20 (PUCAI) & Pediatric CD Activity Index (PCDAI)] kromě konvenčních markerů (CRP, ESR, D-dimery a krevní destičky u aktivního a neaktivního onemocnění). V mnoha případech konvenční cirkulující markery nekorelují s endoskopickými nálezy u aktivního onemocnění; nekonvenční markery mohou vykazovat vyšší senzitivitu při detekci těch s probíhajícím aktivním zánětem.

Metodologie:

1. Sběr klinických dat: Klinická data subjektu budou shromážděna do deidentifikované excelové tabulky z papírového proforma sběru dat, jak se používá v pilotní studii. Shromážděná klinická data budou zahrnovat věk, pohlaví, věk při diagnóze IBD, stav koronární arterie při prezentaci a v současnosti, růst a index tělesné hmotnosti, krevní tlak, rodinnou anamnézu kardiovaskulárního onemocnění a kouření.
2. Chronický zánět bude hodnocen pomocí Meso Scale Discovery (MSD, Maryland, USA) multi-array elektrochemiluminiscenční detekce plazmy: hs-CRP, SAA, TNF-α, IL-6, 8 a 10, MCP-1, VEGF, angiopoetin 1 a 2 (poslední zprostředkovává odchlípení endotelu u systémové vaskulitidy (66). Tato technika umožňuje testování mnoha parametrů z velmi malých množství krve a byla použita (podle pokynů výrobce) s velkým úspěchem v pilotní studii; d. Endoteliální aktivace/poškození bude hodnoceno pomocí: počtu CEC kvantifikovaného izolací imunomagnetických kuliček (IB) z plné krve pomocí kuliček potažených anti-CD146, poté obarvených Ulex konjugovaným s FITC a počítáno pomocí fluorescenční mikroskopie a počítací komůrky Nageotte, jak bylo popsáno dříve naše skupina a další (46;67); EMP exprimující CD105, E-selektin, ICAM-1, VCAM-1 CD144, CD31, ale negativní na markery krevních destiček CD42a nebo CD62P, budou kvantifikovány z plazmy chudé na krevní destičky pomocí průtokového cytometru BD FACSArray, jak bylo dříve popsáno naší skupinou (44 ); E. Potenciál opravy endotelu bude hodnocen u celkem 45 subjektů (15 z každé skupiny: KD CAA+, CAA- a zdravé kontroly) posouzením (i) kapacity jednotky tvořící kolonie EPC (CFU) (68) a (ii) EPC potenciál začlenit se do vaskulárních struktur HUVEC v matrigelu (69), a nyní rutinně prováděné naší skupinou (viz níže). EPC se připraví z PBMC izolovaných z 5 ml krve, nanesou se na kultivační misky potažené lidským fibronektinem a udržují v EGM-2 doplněném 20% fetálním telecím sérem a 40 ng/ml VEGF. Po 4 dnech v kultuře se neadherentní buňky odstraní promytím fyziologickým roztokem pufrovaným fosfátem a adherentní buňky se udržují v kultuře do 7. dne. Poté se spočítají jednotky tvořící časné kolonie EPC. Amplifikované EPC sklizené, jak je popsáno výše, se pak označí Di-I-LDL a přenesou se s HUVEC na vršek ztuhlé matrigelové vrstvy a inkubují se při 37 °C po dobu 24 hodin. Fluorescenční mikroskopie se používá k posouzení začlenění EPC do kapilární mřížky HUVEC a tvorba tubulů HUVEC (struktura vykazující délku čtyřikrát svou šířku) bude porovnána pomocí EPC od KD (+/- CAA) ke zdravým kontrolám. Pro každou jamku se hodnotí pět nezávislých polí a stanoví se průměrný počet tubulů/x100 pole. F. Cévní ztuhlost a karotická IMT budou hodnoceny pomocí: (i) karotické-femorální a karotické-radiální pulzní vlny (PWV) za použití zařízení Vicorder (Skidmore Medical Limited); Všechny tyto techniky naše skupina běžně provádí v souladu s doporučeními AHA (70), jak dokládají naše pilotní data a naše dříve publikované studie (71–73).