Verisuonten toimintahäiriö lasten IBD:ssä

Tutkintasuunnitelma:

Potilaat: 130 lasta ja nuorta (8-21 v) odotettu suhde 60 % (n=78) Crohnin tauti (CD), 35 % (n=45) haavainen paksusuolitulehdus (UC) 5 % (n=6) epämääräinen paksusuolitulehdus (IC). 78-vuotiaat ja sukupuoleen sopivat kontrollit tutkitaan. Näytteen kokolaskelmat perustuvat Circulating Endothelial Cells (CEC) -soluihin ensisijaisena päätepisteenä, kuten ehdotti meneillään oleva tutkimus, jonka yksi hakijoista on tehnyt terveillä lapsilla ja lapsilla, joilla on Kawasakin tauti (Brogan P et al, ref. julkaistu).

40 koehenkilöä/ryhmä vaaditaan havaitsemaan CEC:iden kaksinkertaistuva keskiarvo CD:ssä ja UC:ssa verrattuna kontrolliin 90 %:n teholla, merkitsevyys 0,05, ja tämä pitäisi olla saavutettavissa alkuperäisellä rekrytoinnillamme. Epänormaalisuus ja tarve käyttää ei-parametrisia tai muunnoksia ennen analyysiä lisää luvun 47:ään; siksi pyrimme rekrytoimaan 50 UC-ryhmään. Tämä tarjoaa riittävän tehon, ja se on mahdollista käytettävissämme olevan kliinisen kohortin perusteella.

Tämä potilasryhmä on sopiva ehdokasryhmä tähän tutkimukseen

1. Todisteet osoittavat, että verisuonimuutokset, jotka tapahtuvat 10-20 vuoden iässä, ovat kriittinen tekijä tulevaisuuden verisuoniston terveydelle;
2. Tupakointitottumusten aloittaminen on todennäköisimmin teini-iässä ja
3. Muita vakiintuneita perinteisiä ateroskleroosin riskitekijöitä (kuten verenpainetauti, tyypin II diabetes tai jopa täysin vakiintunut ateroskleroottinen sairaus), jotka toimisivat hämmentävänä muuttujina, ei vielä ole murrosiässä.

Tiedot kootaan tunnistamattomaan Excel-taulukkoon, ja ne sisältävät iän, sukupuolen, iän diagnoosin yhteydessä, sepelvaltimoiden tilan esityshetkellä, kasvun, painoindeksin, verenpaineen, sydän- ja verisuonitautien sukuhistorian ja tupakoinnin.

Tavoite 1: Onko IBD-lapsilla näyttöä MP-välitteisestä protromboottisesta taipumuksesta? MP:t tunnistetaan virtaussytometrialla, kuten ryhmämme on aiemmin kuvannut19. Lyhyesti sanottuna verestä saadaan verihiutalehuono plasma (PPP) ja sitä säilytetään -80 °C:ssa tulevia erätestejä varten. 200 µl PPP:tä mahdollistaa MP:ien sedimentaation, jotka suspensoidaan uudelleen anneksiini V (AnV) -sitoutumispuskuriin ennen värjäystä FITC- tai fykoerytriini-AnV:llä (BD PharMingen). Endoteeli-, verihiutale- ja neutrofiiliperäiset MP:t (EMP:t/PMP:t/NMP:t) ja kudostekijät (TF) luetellaan detektoimalla anti-ihmisillä (CD62E, CD41 ja CD11b-aktivaatioepitooppi, joka sitoutuu vastaavasti aktivoituihin neutrofiileihin sekä asiaankuuluviin isotyyppikontrolliin ). Lateksihelmiä (1,1 μm) käytetään portaamaan MP:t < 1,1 μm. MP:iden tromboottinen potentiaali kvantifioidaan suspendoimalla MP:t kontrollimikrohiukkasvapaaseen plasmaan (MPFP), joka sisältää trypsiini-inhibiittoria [estää kontaktiaktivaation] ja sen jälkeen altistamalla kalsiumfluorogeeniselle substraatille (Z-G-G-R-AMC). Trombiinin muodostumisen kinetiikka tallennetaan jopa 90 minuuttia stimulaation jälkeen. Viiveaika min, trombiinin huippuarvo nM, nopeusindeksi nM/min ja endogeeninen trombiinipotentiaali (ETP) nM × min lasketaan. PS:n ja TF:n suhteellisen osuuden tutkimiseksi MP-välitteisessä trombiinin muodostumisessa MP:itä esi-inkuboidaan kasvavilla pitoisuuksilla rekombinantti-AnV-proteiinia tai salpaavaa anti-TF-ainetta (tai isotyyppikontrollia) ennen trombiinianalyysiä.

Tavoite 2. Onko IBD-lapsilla todisteita endoteelivauriosta? Valtimoiden terveyden (alla) tutkimisen lisäksi määritämme verisuonivauriot mittaamalla CEC:t. CEC:t eristetään immunomagneettisella helmiuutolla (perustuu kansainväliseen konsensusprotokollaan) ja lasketaan käyttämällä Nageotte-kammio/fluoresenssimikroskopiaa. CEC-luettelo määritellään Ulex-europaeus-lektiinin kirkkaiksi soluiksi, joiden koko on >10 μm ja joihin on kiinnitetty 5 magneettihelmeä19. Tiedot analysoidaan EMP-tietojen yhteydessä (tavoite 1), koska yhdistelmä antaa käsityksen endoteelivaurion asteesta IBD:ssä verrattuna kontrolliin.

Tavoite 3. Onko IBD-lapsilla todisteita rakenteellisesta valtimotaudista? Pulse Wave Velocity (PWV) on valtimoiden rakenteellisen terveyden indikaattori. Paineaaltomuodot tallennetaan samanaikaisesti kahdessa kohdassa (karotidi-femoraalinen) VICORDER-analyysiohjelmistolla (Skidmore Medical Limited);

Tavoite 4. Mikä on tulehdusindeksien ja vakiintuneiden verisuonivaurion välittäjien välinen suhde? hs-CRP:n, seerumin amyloidi A:n (SAA), TNF-α:n, IL-1a:n, IL-1β:n, IL-6:n, MCP-1:n, VEGF:n, paastolipidien ja angiopoietiini 1/2:n tasot korreloidaan validoidun kliinisen arvioinnin kanssa. sairauden aktiivisuus [Pediatric UC Activity Index20 (PUCAI) & Pediatric CD Activity Index (PCDAI)] tavanomaisten markkerien (CRP, ESR, D-dimeerit ja verihiutaleet aktiivisessa ja inaktiivisessa sairaudessa) lisäksi. Monissa tapauksissa tavanomaiset kiertävät markkerit eivät korreloi endoskooppisten löydösten kanssa aktiivisessa sairaudessa; ei-tavanomaiset markkerit voivat osoittaa suurempaa herkkyyttä niiden havaitsemisessa, joilla on meneillään oleva aktiivinen tulehdus.

Metodologia:

1. Kliinisen tiedon keruu: Kohteen kliiniset tiedot kootaan tunnistamattomalle Excel-laskentataulukolle pilottitutkimuksessa käytetystä paperinkeräysproformista. Kerätyt kliiniset tiedot sisältävät iän, sukupuolen, iän IBD-diagnoosin yhteydessä, sepelvaltimoiden tilan esittelyhetkellä ja tällä hetkellä, kasvun ja painoindeksin, verenpaineen, sydän- ja verisuonitautien perhehistorian ja tupakoinnin.
2. Krooninen tulehdus arvioidaan käyttämällä plasman Meso Scale Discoveryn (MSD, Maryland, USA) multi-array elektrokemiluminesenssidetektiota: hs-CRP, SAA, TNF-α, IL-6, 8 ja 10, MCP-1, VEGF, angiopoietiini 1 ja 2 (jälkimmäinen välittää endoteelin irtoamista systeemisessä vaskuliitissa (66). Tämä tekniikka mahdollistaa monien parametrien määrittämisen hyvin pienistä verimääristä, ja sitä käytettiin (valmistajan ohjeiden mukaisesti) suurella menestyksellä pilottitutkimuksessa; d. Endoteelin aktivaatio/vaurio arvioidaan seuraavasti: CEC-luku kvantifioidaan immunomagneettisten helmien (IB) eristyksellä kokoverestä käyttämällä anti-CD146-päällystettyjä helmiä, värjätään sitten FITC-konjugoidulla Ulexilla ja lasketaan käyttämällä fluoresoivaa mikroskopiaa ja Nageotte-laskentakammiota, kuten aiemmin on kuvattu. ryhmämme ja muut (46;67); EMP:t, jotka ilmentävät CD105:tä, E-selektiiniä, ICAM-1:tä, VCAM-1 CD144:ää, CD31:tä, mutta ovat negatiivisia verihiutalemarkkereille CD42a tai CD62P, kvantifioidaan verihiutaleiden huonosta plasmasta käyttämällä BD FACSArray -virtaussytometriä, kuten ryhmämme on aiemmin kuvannut (44). ); e. Endoteelin korjauspotentiaali arvioidaan yhteensä 45 koehenkilöllä (15 kustakin ryhmästä: KD CAA+, CAA- ja terveet kontrollit) arvioimalla (i) EPC-pesäkettä muodostavan yksikön (CFU) kapasiteetti (68) ja (ii) EPC. mahdollisuus sisällyttää HUVEC-verisuonirakenteisiin matrigelissa (69), ja ryhmämme suorittaa nyt rutiininomaisesti (katso alla). EPC:t valmistetaan PBMC:istä, jotka on eristetty 5 ml:sta verta, jotka maljataan viljelymaljoille, jotka on päällystetty ihmisen fibronektiinillä ja säilytetään EGM-2:ssa, jota on täydennetty 20 %:lla vasikan sikiön seerumia ja 40 ng/ml VEGF:ää. 4 päivän viljelmän jälkeen kiinnittymättömät solut poistetaan pesemällä fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella ja kiinnittyviä soluja pidetään viljelmässä päivään 7 asti. Varhaiset EPC-pesäkettä muodostavat yksiköt lasketaan sitten. Monistetut EPC:t, jotka on kerätty edellä kuvatulla tavalla, leimataan sitten Di-I-LDL:llä ja maljataan uudelleen HUVEC:llä jähmettyneen matrigeelikerroksen päälle ja inkuboidaan 37 °C:ssa 24 tuntia. Fluoresenssimikroskopiaa käytetään arvioimaan EPC:iden liittymistä HUVEC-kapillaarihilaan, ja HUVEC-tubulusten muodostumista (rakenne, jonka pituus on neljä kertaa leveys) verrataan käyttämällä EPC:tä KD:stä (+/- CAA) terveisiin kontrolleihin. Kutakin kuoppaa kohden arvioidaan viisi riippumatonta kenttää ja määritetään putkien keskimäärä/×100 kenttää. f. Verisuonten jäykkyys ja kaulavaltimon IMT arvioidaan: (i) kaulavaltimon-femoraalin ja kaulavaltimon-radiaalisen pulssiaallon nopeudella (PWV) Vicorder-laitteella (Skidmore Medical Limited); Ryhmämme suorittaa kaikki nämä tekniikat rutiininomaisesti AHA-suositusten mukaisesti (70), kuten pilottitietomme ja aiemmin julkaistut tutkimuksemme (71-73) osoittavat.