小児IBDにおける血管機能不全

調査計画:

患者: 130 人の小児および青少年 (8 ～ 21 歳)、予想される割合は 60% (n=78) クローン病 (CD)、35% (n=45) 潰瘍性大腸炎 (UC) 5% (n=6) 不確定性大腸炎（IC）。 78人の年齢と性別を一致させた対照を調査する。 サンプルサイズの計算は、共同出願人の一人による健康な小児と川崎病の小児を対象とした進行中の研究で示唆されているように、主要評価項目として循環内皮細胞（CEC）に基づいている（Brogan P et al、ref）出版されました）。

40人の被験者/グループは、対照と比較してCDおよびUCにおけるCECの2倍平均を検出力90%、有意性0.05で検出する必要があり、これは最初の募集によって達成可能であるはずである。 非正規性と分析前にノンパラメトリックまたは変換を使用する必要があるため、その数は 47 に増加します。したがって、UC グループへの採用は 50 名を目指します。 これは十分なパワーを提供し、利用可能な臨床コホートに基づいて実現可能です。

この患者コホートは、現在の調査に適切な候補グループです。

1. 10 歳から 20 歳の間に起こる血管の変化が将来の血管構造の健康を決定する重要な要素であることを示す証拠があります。
2. 喫煙習慣が始まるのはおそらく 10 代であり、
3. 交絡変数として作用する、アテローム性動脈硬化症の他の確立された従来の危険因子（高血圧、II型糖尿病、さらには完全に確立されたアテローム性動脈硬化性疾患など）は、思春期にはまだ存在しません。

データは匿名化された Excel シートに照合され、年齢、性別、診断時年齢、受診時の冠動脈状態、成長、BMI、血圧、CVD の家族歴、喫煙状況などが含まれます。

目的 1: IBD の子供には MP 媒介血栓形成傾向の証拠があるか? MP は、我々のグループが以前に説明したように、フローサイトメトリーによって特定されます 19。 簡単に説明すると、貧血小板血漿 (PPP) は血液から取得され、将来のバッチ検査に備えて -80 °C で保存されます。 200 μL の PPP により MP が沈降し、FITC-またはフィコエリトリン -AnV (BD PharMingen) で染色する前にアネキシン V (AnV) 結合バッファーに再懸濁されます。 内皮、血小板、好中球由来の MP (EMP/PMP/NMP) および組織因子 (TF) は、抗ヒト (それぞれ活性化された好中球に結合する CD62E、CD41、および CD11b 活性化エピトープ、および関連するアイソタイプ コントロール) による検出によって列挙されます。 ）。 ラテックスビーズ (1.1 μm) は、MP < 1.1 μm をゲートするために使用されます。 MP の血栓形成能は、トリプシン阻害剤 [接触活性化を阻害する] を含むコントロール無粒子血漿 (MPFP) に MP を懸濁し、その後カルシウム蛍光基質 (Z-G-G-R-AMC) に曝露することによって定量されます。 トロンビン生成の動態は、刺激後 90 分まで記録されます。 ラグタイム min、ピーク トロンビン nM、速度指数 nM/min、および内因性トロンビン ポテンシャル (ETP) nM × min が計算されます。 MP 媒介トロンビン生成に対する PS と TF の相対的な寄与を調べるために、トロンビン分析の前に、MP を漸増濃度の組換え AnV タンパク質またはブロッキング抗 TF (またはアイソタイプ コントロール) とプレインキュベートします。

目的 2. IBD の子供には内皮損傷の証拠があるか? 動脈の健康状態の調査 (下記) に加えて、CEC を測定することで血管損傷を定量化します。 CEC は免疫磁気ビーズ抽出 (国際コンセンサスプロトコルに基づく) によって分離され、Nageotte チャンバー/蛍光顕微鏡を使用して計数されます。 CEC の列挙は、5 つの磁気ビーズが取り付けられた、サイズが 10 μm を超える Ulex-europaeus-lectin の明るい細胞として定義されます 19。 この組み合わせにより、対照と比較した IBD の内皮損傷の程度についての洞察が得られるため、データは EMP データとの関連で分析されます (目的 1)。

目的 3. IBD の子供には構造性動脈疾患の証拠があるか? 脈波伝播速度 (PWV) は、動脈の構造的健康状態の指標となります。 圧力波形は、VICORDER 分析ソフトウェア (Skidmore Medical Limited) を使用して 2 つの部位 (頸動脈-大腿部) で同時に記録されます。

目的 4. 炎症の指標と血管損傷の確立されたメディエーターとの関係は何ですか? hs-CRP、血清アミロイド A (SAA)、TNF-α、IL-1α、IL-1β、IL-6、MCP-1、VEGF、空腹時脂質およびアンジオポエチン 1/2 のレベルは、検証された臨床評価と相関します。従来のマーカー（活動性および非活動性疾患におけるCRP、ESR、D-ダイマーおよび血小板）に加えて、疾患活動性[小児UC活動指数20（PUCAI）および小児CD活動指数（PCDAI）]。 多くの場合、従来の循環マーカーは活動性疾患の内視鏡所見と相関しません。従来とは異なるマーカーは、進行中の活動性炎症を伴うマーカーを検出する際に、より高い感度を示す可能性があります。

方法論:

1. 臨床データ収集: 被験者の臨床データは、パイロット研究で使用された紙のデータ収集プロフォーマから匿名化された Excel スプレッドシートに照合されます。 収集される臨床データには、年齢、性別、IBD​​診断時の年齢、発症時および現在の冠動脈の状態、成長指数およびBMI、血圧、心血管疾患の家族歴、喫煙状況などが含まれます。
2. 慢性炎症は、血漿の Meso Scale Discovery (MSD、メリーランド州、米国) マルチアレイ電気化学発光検出を使用して評価されます: hs-CRP、SAA、TNF-α、IL-6、8 および 10、MCP-1、VEGF、アンジオポエチン 1および 2 (後者は全身性血管炎における内皮剥離を媒介します (66)。 この技術により、非常に少量の血液から多くのパラメータを分析することができ、（メーカーの指示に従って）パイロット研究で大成功を収めました。 d. 内皮活性化/損傷は以下によって評価されます: CEC 数は、抗 CD146 コーティングビーズを使用して全血から免疫磁気ビーズ (IB) 単離によって定量化され、その後 FITC 結合 Ulex で染色され、蛍光顕微鏡と Nageotte 計数チャンバーを使用して計数されます。私たちのグループと他のグループ (46;67); CD105、E-セレクチン、ICAM-1、VCAM-1 CD144、CD31 を発現しているが、血小板マーカー CD42a または CD62P が陰性である EMP は、我々のグループが以前に記載したように、BD FACSArray フローサイトメーターを使用して乏血小板血漿から定量されます (44 ); e.内皮修復の可能性は、(i) EPC コロニー形成単位 (CFU) 能力 (68 人)、および (ii) EPC を評価することによって、合計 45 人の被験者 (各グループから 15 人: KD CAA+、CAA-、および健康な対照) で評価されます。マトリゲル中の HUVEC 血管構造に組み込まれる可能性があり (69)、現在我々のグループによって日常的に実施されています (下記を参照)。 EPCは、5mlの血液から単離されたPBMCから調製され、ヒトフィブロネクチンでコーティングされた培養皿にプレーティングされ、20％ウシ胎児血清および40ng/ml VEGFを補充したEGM-2中で維持される。 培養4日後、リン酸緩衝生理食塩水で洗浄することにより非付着細胞を除去し、付着細胞を7日目まで培養状態に維持します。その後、初期のEPCコロニー形成単位をカウントします。 次に、上記のように採取した増幅 EPC を Di -I-LDL で標識し、固化マトリゲル層の上に HUVEC を再播種し、37 °C で 24 時間インキュベートします。 蛍光顕微鏡を使用して、HUVEC 毛細管格子への EPC の取り込みを評価し、HUVEC 尿細管形成 (幅の 4 倍の長さを示す構造) を、EPC を使用して KD (+/- CAA) から健康な対照まで比較します。 各ウェルについて 5 つの独立したフィールドが評価され、平均細管数/×100 フィールドが決定されます。 f. 血管の硬さおよび頸動脈 IMT は、以下によって評価されます。(i) Vicorder デバイス (Skidmore Medical Limited) を使用した頸動脈-大腿部および頸動脈-橈骨方向の脈波伝播速度 (PWV)。これらすべての技術は、私たちのパイロット データと以前に発表された研究 (71-73) で示されているように、AHA の推奨事項 (70) に従って私たちのグループによって日常的に実行されています。