Gefäßdysfunktion bei pädiatrischer IBD

Untersuchungsplan:

Patienten: 130 Kinder und Jugendliche (8–21 Jahre) mit einem erwarteten Anteil von 60 % (n=78) Morbus Crohn (CD), 35 % (n=45) Colitis ulcerosa (UC) 5 % (n=6) unbestimmte Colitis (IC). Es werden 78 alters- und geschlechtsangepasste Kontrollpersonen untersucht. Berechnungen der Stichprobengröße basieren auf zirkulierenden Endothelzellen (CECs) als primärem Endpunkt, wie aus einer laufenden Studie eines der Mitantragsteller an gesunden Kindern und Kindern mit Kawasaki-Krankheit hervorgeht (Brogan P et al, Ref veröffentlicht).

40 Probanden pro Gruppe sind erforderlich, um einen verdoppelten Durchschnitt der CECs bei CD und UC im Vergleich zur Kontrolle mit einer Aussagekraft von 90 % und einer Signifikanz von 0,05 zu ermitteln. Dies sollte durch unsere Erstrekrutierung erreichbar sein. Durch Nichtnormalität und die Notwendigkeit, vor der Analyse eine nichtparametrische Methode oder eine Transformation zu verwenden, erhöht sich die Zahl auf 47; Daher werden wir versuchen, 50 Mitarbeiter für die UC-Gruppe zu rekrutieren. Dies stellt eine ausreichende Leistung bereit und ist auf der Grundlage der uns zur Verfügung stehenden klinischen Kohorte machbar.

Diese Patientenkohorte ist eine geeignete Kandidatengruppe für die vorliegende Untersuchung

1. Es gibt Hinweise darauf, dass Gefäßveränderungen, die im Alter zwischen 10 und 20 Jahren auftreten, ein entscheidender Faktor für die zukünftige Gesundheit des Gefäßsystems sind.
2. Der Einstieg in das Rauchen erfolgt am wahrscheinlichsten im Teenageralter
3. Andere etablierte traditionelle Risikofaktoren für Atherosklerose (wie Bluthochdruck, Typ-II-Diabetes oder sogar vollständig etablierte atherosklerotische Erkrankungen), die als Störvariablen wirken würden, sind im Jugendalter noch nicht vorhanden.

Die Daten werden auf einem nicht identifizierten Excel-Blatt gesammelt und umfassen Alter, Geschlecht, Alter bei der Diagnose, Status der Koronararterien bei der Vorstellung, Wachstum, Body-Mass-Index, Blutdruck, familiäre Vorgeschichte von Herz-Kreislauf-Erkrankungen und Raucherstatus.

Ziel 1: Haben Kinder mit IBD Hinweise auf eine MP-vermittelte prothrombotische Tendenz? MPs werden durch Durchflusszytometrie identifiziert, wie zuvor von unserer Gruppe beschrieben19. Kurz gesagt, plättchenarmes Plasma (PPP) wird aus Blut gewonnen und für zukünftige Chargentests bei -80 °C gelagert. 200 μl PPP ermöglichen die Sedimentation von MPs, die vor der Färbung mit FITC- oder Phycoerythrin-AnV (BD PharMingen) in Annexin V (AnV)-Bindungspuffer resuspendiert werden. Von Endothelzellen, Blutplättchen und Neutrophilen abgeleitete MPs (EMPs/PMPs/NMPs) und Gewebefaktoren (TF) werden durch Nachweis mit Anti-Human-Aktivierungsepitopen (CD62E, CD41 und CD11b), die jeweils an aktivierte Neutrophile binden, sowie relevanten Isotypkontrollen gezählt ). Latexkügelchen (1,1 μm) werden verwendet, um MPs < 1,1 μm zu steuern. Das thrombotische Potenzial von MPs wird quantifiziert, indem MPs in mikropartikelfreiem Kontrollplasma (MPFP) suspendiert werden, das Trypsininhibitor enthält [hemmt die Kontaktaktivierung], gefolgt von der Exposition gegenüber kalzium-fluorogenem Substrat (Z-G-G-R-AMC). Die Kinetik der Thrombinbildung wird bis zu 90 Minuten nach der Stimulation aufgezeichnet. Es werden Verzögerungszeit (min), Peak-Thrombin (nM), Geschwindigkeitsindex (nM/min) und endogenes Thrombinpotential (ETP) (nM × min) berechnet. Um den relativen Beitrag von PS und TF zur MP-vermittelten Thrombinerzeugung zu untersuchen, werden MPs vor der Thrombinanalyse mit steigenden Konzentrationen an rekombinantem AnV-Protein oder einem blockierenden Anti-TF (oder einer Isotypkontrolle) vorinkubiert.

Ziel 2. Haben Kinder mit IBD Hinweise auf eine Endothelschädigung? Zusätzlich zur Untersuchung der Arteriengesundheit (unten) werden wir Gefäßverletzungen durch Messung von CECs quantifizieren. CECs werden durch immunmagnetische Perlenextraktion (basierend auf einem internationalen Konsensprotokoll) isoliert und unter Verwendung einer Nageotte-Kammer/Fluoreszenzmikroskopie gezählt. Die CEC-Zählung ist definiert als helle Ulex-europaeus-lectin-Zellen mit einer Größe von >10 μm, an denen 5 Magnetkügelchen befestigt sind19. Die Daten werden im Kontext der EMP-Daten (Ziel 1) analysiert, da die Kombination einen Einblick in den Grad der Endothelschädigung bei IBD im Vergleich zur Kontrolle geben wird.

Ziel 3. Haben Kinder mit IBD Hinweise auf eine strukturelle arterielle Erkrankung? Die Pulswellengeschwindigkeit (PWV) ist ein Indikator für die strukturelle Gesundheit der Arterien. Druckwellenformen werden gleichzeitig an zwei Stellen (Karotis-Femur) mit der VICORDER-Analysesoftware (Skidmore Medical Limited) aufgezeichnet.

Ziel 4. Welche Beziehung besteht zwischen Entzündungsindizes und etablierten Mediatoren von Gefäßverletzungen? Die Werte von hs-CRP, Serumamyloid A (SAA), TNF-α, IL-1α, IL-1β, IL-6, MCP-1, VEGF, Nüchternlipiden und Angiopoietin 1/2 werden mit einer validierten klinischen Bewertung korreliert Krankheitsaktivität [Paediatric UC Activity Index20 (PUCAI) & Pediatric CD Activity Index (PCDAI)] zusätzlich zu herkömmlichen Markern (CRP, ESR, D-Dimere und Blutplättchen bei aktiver und inaktiver Erkrankung). In vielen Fällen korrelieren herkömmliche zirkulierende Marker nicht mit endoskopischen Befunden bei aktiver Erkrankung; Die unkonventionellen Marker zeigen möglicherweise eine höhere Empfindlichkeit bei der Erkennung von Personen mit anhaltender aktiver Entzündung.

Methodik:

1. Klinische Datenerfassung: Die klinischen Daten des Probanden werden auf einer nicht identifizierten Excel-Tabelle aus einem Proforma zur Datenerfassung in Papierform, wie es in der Pilotstudie verwendet wurde, zusammengestellt. Zu den gesammelten klinischen Daten gehören Alter, Geschlecht, Alter bei der IBD-Diagnose, Status der Koronararterien bei der Vorstellung und aktuell, Wachstum und Body-Mass-Index, Blutdruck, familiäre Vorgeschichte von Herz-Kreislauf-Erkrankungen und Raucherstatus.
2. Chronische Entzündungen werden mithilfe der Multi-Array-Elektrochemilumineszenzdetektion von Plasma von Meso Scale Discovery (MSD, Maryland, USA) beurteilt: hs-CRP, SAA, TNF-α, IL-6, 8 und 10, MCP-1, VEGF, Angiopoietin 1 und 2 (Letzteres vermittelt die Endothelablösung bei systemischer Vaskulitis (66). Diese Technik ermöglicht die Bestimmung vieler Parameter aus sehr kleinen Blutmengen und wurde (gemäß den Anweisungen des Herstellers) mit großem Erfolg in der Pilotstudie eingesetzt; D. Die Aktivierung/Verletzung des Endothels wird beurteilt durch: CEC-Anzahl, quantifiziert durch Isolierung immunomagnetischer Kügelchen (IB) aus Vollblut unter Verwendung von Anti-CD146-beschichteten Kügelchen, dann mit FITC-konjugiertem Ulex gefärbt und unter Verwendung von Fluoreszenzmikroskopie und einer Nageotte-Zählkammer gezählt, wie zuvor beschrieben von unsere Gruppe und andere (46;67); EMPs, die CD105, E-Selectin, ICAM-1, VCAM-1 CD144, CD31 exprimieren, aber negativ für die Thrombozytenmarker CD42a oder CD62P sind, werden aus plättchenarmem Plasma unter Verwendung eines BD FACSArray-Durchflusszytometers quantifiziert, wie zuvor von unserer Gruppe beschrieben (44). ); e. Das endotheliale Reparaturpotenzial wird bei insgesamt 45 Probanden (15 aus jeder Gruppe: KD CAA+, CAA- und gesunde Kontrollpersonen) durch Bewertung (i) der EPC-Kapazität der koloniebildenden Einheit (CFU) (68) und (ii) der EPC beurteilt Potenzial für den Einbau in HUVEC-Gefäßstrukturen in Matrigel (69) und wird jetzt routinemäßig von unserer Gruppe durchgeführt (siehe unten). EPCs werden aus PBMCs hergestellt, die aus 5 ml Blut isoliert wurden, in mit menschlichem Fibronektin beschichtete Kulturschalen ausplattiert und in EGM-2, ergänzt mit 20 % fötalem Kälberserum und 40 ng/ml VEGF, gehalten werden. Nach 4 Tagen in Kultur werden nicht anhaftende Zellen durch Waschen mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung entfernt und die anhaftenden Zellen bis zum 7. Tag in Kultur gehalten. Anschließend werden frühe EPC-Koloniebildungseinheiten gezählt. Die wie oben beschrieben geernteten amplifizierten EPCs werden dann mit Di-I-LDL markiert und mit HUVEC auf einer verfestigten Matrigelschicht erneut ausplattiert und 24 Stunden lang bei 37 °C inkubiert. Fluoreszenzmikroskopie wird verwendet, um den Einbau von EPCs in das HUVEC-Kapillargitter zu beurteilen, und die Bildung von HUVEC-Tubuli (Struktur mit einer Länge, die das Vierfache ihrer Breite aufweist) wird mithilfe von EPC von KD (+/- CAA) mit gesunden Kontrollpersonen verglichen. Für jede Vertiefung werden fünf unabhängige Felder bewertet und die mittlere Anzahl an Tubuli/×100 Feld bestimmt. F. Gefäßsteifheit und Karotis-IMT werden beurteilt durch: (i) Karotis-Femoral- und Karotis-Radial-Pulswellengeschwindigkeit (PWV) unter Verwendung des Vicorder-Geräts (Skidmore Medical Limited); Alle diese Techniken werden von unserer Gruppe routinemäßig gemäß den AHA-Empfehlungen (70) durchgeführt, wie unsere Pilotdaten und unsere zuvor veröffentlichten Studien (71–73) zeigen.