Disfunzione vascolare nell'IBD pediatrico

Piano di indagine:

Pazienti: 130 bambini e adolescenti (8-21 anni) con un rapporto atteso del 60% (n=78) morbo di Crohn (CD), 35% (n=45) colite ulcerosa (CU) 5% (n=6) colite indeterminata (CIRCUITO INTEGRATO). Verranno studiati 78 controlli appaiati per età e sesso. I calcoli delle dimensioni del campione si basano sulle cellule endoteliali circolanti (CEC) come endpoint primario, come suggerito da uno studio in corso di uno dei co-richiedenti, su bambini sani e bambini con malattia di Kawasaki (Brogan P et al, rif. pubblicato).

40 soggetti/gruppo sono tenuti a rilevare una media doppia di CEC in MC e UC rispetto al controllo con una potenza del 90%, significatività 0,05 e questo dovrebbe essere possibile con il nostro reclutamento iniziale. La non normalità e la necessità di utilizzare non parametrici o trasformare prima dell'analisi, aumenta il numero a 47; quindi mireremo a reclutare 50 persone nel gruppo UC. Ciò fornirà una potenza adeguata ed è fattibile in base alla coorte clinica a nostra disposizione.

Questa coorte di pazienti è un gruppo candidato appropriato per la presente indagine come

1. Le prove indicano che i cambiamenti vascolari che si verificano tra i 10 ei 20 anni di età sono un fattore determinante per la salute futura della vascolarizzazione;
2. L'iniziazione all'abitudine al fumo è molto probabile negli anni dell'adolescenza e
3. Altri fattori di rischio tradizionali stabiliti per l'aterosclerosi (come l'ipertensione, il diabete di tipo II o anche la malattia aterosclerotica completamente accertata) che agirebbero come variabili confondenti, non sono ancora presenti nell'adolescenza.

I dati saranno raccolti su un foglio Excel non identificato e includeranno età, sesso, età alla diagnosi, stato dell'arteria coronarica alla presentazione, crescita, indice di massa corporea, pressione sanguigna, storia familiare di CVD e abitudine al fumo.

Obiettivo 1: I bambini con IBD hanno evidenza di una tendenza protrombotica mediata da MP? Le MP saranno identificate mediante citometria a flusso come precedentemente descritto dal nostro gruppo19. In breve, il plasma povero di piastrine (PPP) sarà ottenuto dal sangue e conservato a -80 °C per futuri test in lotti. 200 μL di PPP consentiranno la sedimentazione dei MP che saranno risospesi nel buffer di legame dell'allegato V (AnV) prima della colorazione con FITC- o ficoeritrina-AnV (BD PharMingen). MP endoteliali, piastriniche e di derivazione neutrofila (EMPs/PMPs/NMPs) e Tissue-Factor (TF) saranno enumerati mediante rilevazione con anti-umano (epitopo di attivazione di CD62E, CD41 e CD11b che si lega rispettivamente ai neutrofili attivati, oltre a controlli isotipici pertinenti ). Perle di lattice (1,1 μm) vengono utilizzate per gate MP <1,1 μm. Il potenziale trombotico delle MP sarà quantificato sospendendo le MP nel plasma di controllo privo di microparticelle (MPFP) contenente l'inibitore della tripsina [inibisce l'attivazione da contatto] seguita dall'esposizione al substrato calcio-fluorogenico (Z-G-G-R-AMC). La cinetica della generazione di trombina sarà registrata fino a 90 minuti dopo la stimolazione. Saranno calcolati il ​​tempo di ritardo min, il picco di trombina nM, l'indice di velocità nM/min e il potenziale endogeno di trombina (ETP) nM × min. Per studiare il contributo relativo di PS e TF alla generazione di trombina mediata da MP, le MP saranno pre-incubate con concentrazioni crescenti di proteina AnV ricombinante o un anti-TF bloccante (o controllo isotipico) prima dell'analisi della trombina.

Obiettivo 2. I bambini con IBD hanno evidenza di lesione endoteliale? Oltre a indagare sulla salute arteriosa (sotto), quantificheremo il danno vascolare misurando i CEC. I CEC saranno isolati mediante estrazione immunomagnetica di biglie (basata su un protocollo di consenso internazionale) e contati utilizzando una camera di Nageotte/microscopia a fluorescenza. L'enumerazione CEC è definita come celle luminose di Ulex-europaeus-lectina di dimensioni >10 μm, con 5 sfere magnetiche attaccate19. I dati saranno analizzati nel contesto dei dati EMP (Obiettivo 1) poiché la combinazione fornirà una panoramica del grado di lesione endoteliale nell'IBD rispetto al controllo.

Obiettivo 3. I bambini con IBD hanno evidenza di Arteriopatia Strutturale? La velocità dell'onda di polso (PWV) sarà un indicatore della salute strutturale arteriosa. Le forme d'onda della pressione saranno registrate simultaneamente in due siti (carotideo-femorale) utilizzando il software di analisi VICORDER (Skidmore Medical Limited);

Obiettivo 4. Qual è la relazione tra indici di infiammazione e mediatori stabiliti di danno vascolare? I livelli di hs-CRP, amiloide sierica A (SAA), TNF-α, IL-1α, IL-1β, IL-6, MCP-1, VEGF, lipidi a digiuno e angiopoietina 1/2 saranno correlati con la valutazione clinica validata di attività della malattia [Paediatric CU Activity Index20 (PUCAI) e Pediatric CD Activity Index (PCDAI)] in aggiunta ai marcatori convenzionali (CRP, VES, D-Dimeri e piastrine nella malattia attiva e inattiva). In molti casi, i marcatori circolanti convenzionali non sono correlati ai risultati endoscopici nella malattia attiva; i marcatori non convenzionali possono mostrare una maggiore sensibilità nel rilevare quelli con infiammazione attiva in corso.

Metodologia:

1. Raccolta di dati clinici: i dati clinici del soggetto verranno raccolti su un foglio di calcolo Excel anonimizzato da una raccolta di dati cartacei proforma utilizzata nello studio pilota. I dati clinici raccolti includeranno età, sesso, età alla diagnosi di IBD, stato dell'arteria coronarica alla presentazione e attualmente, crescita e indice di massa corporea, pressione sanguigna, storia familiare di malattie cardiovascolari e abitudine al fumo.
2. L'infiammazione cronica sarà valutata utilizzando il rilevamento dell'elettrochemiluminescenza multi-array Meso Scale Discovery (MSD, Maryland, USA) del plasma: hs-CRP, SAA, TNF-α, IL-6, 8 e 10, MCP-1, VEGF, angiopoietina 1 e 2 (quest'ultimo media il distacco endoteliale nella vasculite sistemica (66). Questa tecnica consente di analizzare molti parametri da piccolissime quantità di sangue ed è stata utilizzata (secondo le istruzioni del produttore) con grande successo nello studio pilota; D. L'attivazione/lesione endoteliale sarà valutata mediante: conta CEC quantificata mediante isolamento di sferette immunomagnetiche (IB) da sangue intero utilizzando sferette rivestite con anti-CD146, quindi colorato con Ulex coniugato con FITC ed enumerato mediante microscopia a fluorescenza e una camera di conteggio Nageotte come descritto in precedenza da il nostro gruppo e altri (46;67); Gli EMP che esprimono CD105, E-selectina, ICAM-1, VCAM-1 CD144, CD31, ma negativi per i marcatori piastrinici CD42a o CD62P saranno quantificati dal plasma povero di piastrine utilizzando un citometro a flusso BD FACSArray come precedentemente descritto dal nostro gruppo (44 ); e. Il potenziale di riparazione endoteliale sarà valutato in un totale di 45 soggetti (15 per ciascun gruppo: KD CAA+, CAA- e controlli sani) valutando (i) la capacità dell'unità formante colonia (CFU) di EPC (68) e (ii) EPC potenziale da incorporare nelle strutture vascolari HUVEC in matrigel (69), e ora eseguito di routine dal nostro gruppo (vedi sotto). Le EPC vengono preparate da PBMC isolate da 5 ml di sangue, vengono piastrate in piastre di coltura rivestite con fibronectina umana e mantenute in EGM-2 integrato con il 20% di siero di vitello fetale e 40 ng/ml di VEGF. Dopo 4 giorni di coltura, le cellule non aderenti vengono rimosse mediante lavaggio con soluzione salina tamponata con fosfato e le cellule aderenti vengono mantenute in coltura fino al giorno 7. Vengono quindi contate le prime unità formanti colonie di EPC. Le EPC amplificate raccolte come descritto sopra vengono quindi etichettate con Di -I-LDL e sostituite con HUVEC sopra uno strato di matrigel solidificato e incubate a 37 ° C per 24 ore. La microscopia a fluorescenza viene utilizzata per valutare l'incorporazione di EPC nel reticolo capillare HUVEC e la formazione del tubulo HUVEC (struttura che mostra una lunghezza quattro volte la sua larghezza) verrà confrontata utilizzando EPC da KD (+/- CAA) a controlli sani. Per ciascun pozzetto vengono valutati cinque campi indipendenti e viene determinato il numero medio di tubuli/campo ×100. F. La rigidità vascolare e l'IMT carotideo saranno valutati mediante: (i) velocità dell'onda del polso carotideo-femorale e carotideo-radiale (PWV) utilizzando il dispositivo Vicorder (Skidmore Medical Limited); Tutte queste tecniche vengono eseguite di routine dal nostro gruppo in conformità con le raccomandazioni dell'AHA (70), come illustrato dai nostri dati pilota e dai nostri studi precedentemente pubblicati (71-73).