Vaskulär dysfunktion vid pediatrisk IBD

Undersökningsplan:

Patienter: 130 barn och ungdomar (8-21 år) med ett förväntat förhållande på 60% (n=78) Crohns sjukdom (CD), 35% (n=45) Ulcerös kolit (UC) 5% (n=6) Obestämd kolit (IC). 78 ålders- och könsmatchade kontroller kommer att undersökas. Provstorleksberäkningar är baserade på cirkulerande endotelceller (CEC) som den primära slutpunkten, vilket föreslås av en pågående studie av en av de medsökande, på friska barn och barn med Kawasakis sjukdom (Brogan P et al, ref. publiceras).

40 försökspersoner/grupp krävs för att upptäcka ett fördubblat medelvärde av CECs i CD och UC jämfört med kontroll med 90 % effekt, signifikans 0,05 och detta bör kunna uppnås genom vår första rekrytering. Icke-normalitet och behovet av att använda icke-parametrisk eller transformation före analys, ökar antalet till 47; därför kommer vi att sträva efter att rekrytera 50 till UC-gruppen. Detta kommer att ge tillräcklig kraft och är genomförbart baserat på den kliniska kohorten som är tillgänglig för oss.

Denna patientkohort är en lämplig kandidatgrupp för den aktuella utredningen som

1. Bevis tyder på att kärlförändringar som inträffar mellan 10-20 års ålder är en avgörande faktor för framtida kärlhälsa;
2. Initiering av rökvanor är mest sannolikt i tonåren och
3. Andra etablerade traditionella riskfaktorer för ateroskleros (såsom hypertoni, typ II-diabetes eller till och med fullt etablerad aterosklerotisk sjukdom) som skulle fungera som förvirrande variabler finns ännu inte i tonåren.

Data kommer att samlas på ett avidentifierat excel-ark och kommer att inkludera ålder, kön, ålder vid diagnos, kranskärlsstatus vid presentation, tillväxt, body mass index, blodtryck, familjehistoria av CVD och rökstatus.

Mål 1: Har barn med IBD tecken på en MP-medierad protrombotisk tendens? MPs kommer att identifieras med flödescytometri som tidigare beskrivits av vår grupp19. Kortfattat kommer blodplättsfattig plasma (PPP) att erhållas från blod och förvaras vid -80 °C för framtida batchtestning. 200 μL PPP kommer att tillåta sedimentering av MP:er som kommer att återsuspenderas i Annexin V (AnV) bindande buffert innan färgning med FITC- eller phycoerythrin-AnV (BD PharMingen). Endotel-, trombocyt- och neutrofilhärledda MP (EMPs/PMPs/NMPs) och Tissue-Factor (TF) kommer att räknas upp genom detektion med antihuman (CD62E, CD41 och CD11b aktiveringsepitop som binder till aktiverade neutrofiler respektive, plus relevanta isotypkontroller ). Latexpärlor (1,1 μm) används för att gate MPs < 1,1 μm. Den trombotiska potentialen hos MP kommer att kvantifieras genom att suspendera MP i kontrollmikropartikelfri plasma (MPFP) som innehåller trypsinhämmare [hämmar kontaktaktivering] följt av exponering för kalciumfluorogent substrat (Z-G-G-R-AMC). Kinetiken för trombingenerering kommer att registreras upp till 90 minuter efter stimulering. Lagtid min, topp trombin nM, hastighetsindex nM/min och endogen trombinpotential (ETP) nM × min kommer att beräknas. För att undersöka det relativa bidraget av PS och TF till MP-medierad trombingenerering, kommer MP:er att förinkuberas med ökande koncentrationer av rekombinant AnV-protein eller en blockerande anti-TF (eller isotypkontroll) före trombinanalys.

Syfte 2. Har barn med IBD tecken på endotelskada? Förutom att undersöka arteriell hälsa (nedan), kommer vi att kvantifiera vaskulär skada genom att mäta CEC. CECs kommer att isoleras genom immunomagnetisk pärlextraktion (baserat på ett internationellt konsensusprotokoll) och räknas med en Nageotte-kammare/fluorescensmikroskopi. CEC-uppräkning definieras som Ulex-europaeus-lectin ljusa celler av >10 μm i storlek, med 5 magnetiska pärlor fästa19. Data kommer att analyseras i samband med EMP-data (Aim 1) eftersom kombinationen kommer att ge en inblick i graden av endotelskada vid IBD kontra kontroll.

Syfte 3. Har barn med IBD tecken på strukturell arteriell sjukdom? Pulse Wave Velocity (PWV) kommer att vara en indikator på arteriell strukturell hälsa. Tryckvågformer kommer att registreras samtidigt på två platser (carotis-femoral) med hjälp av VICORDER-analysmjukvaran (Skidmore Medical Limited);

Syfte 4. Vilket är sambandet mellan inflammationsindex och etablerade mediatorer av vaskulär skada? Nivåer av hs-CRP, serumamyloid A (SAA), TNF-α, IL-1α, IL-1β, IL-6, MCP-1, VEGF, fastande lipider och angiopoietin 1/2 kommer att korreleras med validerad klinisk bedömning av sjukdomsaktivitet [Pediatric UC Activity Index20 (PUCAI) & Pediatric CD Activity Index (PCDAI)] förutom konventionella markörer (CRP, ESR, D-Dimerer och blodplättar vid aktiv och inaktiv sjukdom). I många fall korrelerar inte konventionella cirkulerande markörer med endoskopiska fynd vid aktiv sjukdom; de icke-konventionella markörerna kan visa en högre känslighet för att upptäcka personer med pågående aktiv inflammation.

Metodik:

1. Klinisk datainsamling: Kliniska data från ämnet kommer att samlas på ett avidentifierat excel-kalkylblad från en pappersdatainsamlingsproforma som användes i pilotstudien. Kliniska data som samlas in kommer att inkludera ålder, kön, ålder vid IBD-diagnos, kranskärlsstatus vid presentation och för närvarande, tillväxt och body mass index, blodtryck, familjehistoria av kardiovaskulär sjukdom och rökstatus.
2. Kronisk inflammation kommer att bedömas med hjälp av Meso Scale Discovery (MSD, Maryland, USA) multi-array elektrokemiluminescensdetektion av plasma: hs-CRP, SAA, TNF-α, IL-6, 8 och 10, MCP-1, VEGF, angiopoietin 1 och 2 (den senare förmedlar endotelavlossning vid systemisk vaskulit (66). Denna teknik gör att många parametrar kan analyseras från mycket små mängder blod och användes (enligt tillverkarens instruktioner) med stor framgång i pilotstudien; d. Endotelaktivering/skada kommer att bedömas genom: CEC-antal kvantifierat genom immunomagnetisk pärla (IB) isolering från helblod med anti-CD146-belagda pärlor, färgas sedan med FITC-konjugerad Ulex och räknas med fluorescensmikroskopi och en Nageotte-räknekammare som tidigare beskrivits av vår grupp och andra (46;67); EMP som uttrycker CD105, E-selektin, ICAM-1, VCAM-1 CD144, CD31, men negativa för trombocytmarkörerna CD42a eller CD62P kommer att kvantifieras från blodplättsfattig plasma med hjälp av en BD FACSArray flödescytometer som tidigare beskrivits av vår grupp (44) ); e. Endotelreparationspotential kommer att bedömas hos totalt 45 försökspersoner (15 från varje grupp: KD CAA+, CAA- och friska kontroller) genom att bedöma (i) EPC-kolonibildande enhets (CFU) kapacitet (68) och (ii) EPC potential att införlivas i HUVEC vaskulära strukturer i matrigel (69), och nu utförs rutinmässigt av vår grupp (se nedan). EPC:er framställs från PBMC:er isolerade från 5 ml blod och ströks ut i odlingsskålar belagda med humant fibronektin och hålls i EGM-2 kompletterat med 20 % fetalt kalvserum och 40 ng/ml VEGF. Efter 4 dagar i odling avlägsnas icke-vidhäftande celler genom tvättning med fosfatbuffrad saltlösning och de vidhäftande cellerna bibehålls i kultur till dag 7. Tidiga EPC-kolonibildande enheter räknas sedan. Amplifierade EPCs skördade enligt beskrivningen ovan märks sedan med Di-I-LDL och stryks om med HUVEC ovanpå ett stelnat matrigelskikt och inkuberas vid 37 °C i 24 timmar. Fluorescensmikroskopi används för att bedöma inkorporering av EPC i HUVEC kapillärgittret, och HUVEC-tubulibildning (struktur som uppvisar längd fyra gånger dess bredd) kommer att jämföras med EPC från KD (+/- CAA) med friska kontroller. Fem oberoende fält bedöms för varje brunn, och medelantalet tubuli/×100 fält bestäms. f. Vaskulär stelhet och carotis IMT kommer att bedömas genom: (i) carotis-femoral och carotis-radial pulse wave velocity (PWV) med hjälp av Vicorder-enheten (Skidmore Medical Limited); Alla dessa tekniker utförs rutinmässigt av vår grupp i enlighet med AHA-rekommendationer (70), vilket illustreras av våra pilotdata och våra tidigare publicerade studier (71-73).