Vaszkuláris diszfunkció gyermekkori IBD-ben

Vizsgálati terv:

Betegek: 130 gyermek és serdülő (8-21 éves), várható arány 60% (n=78) Crohn-betegség (CD), 35% (n=45) Colitis ulcerosa (UC) 5% (n=6) Indeterminált vastagbélgyulladás (IC). 78 éves korú és nemű kontrollokat vizsgálnak meg. A mintanagyság számításai a keringő endothelsejteken (CEC) alapulnak, mint elsődleges végponton, amint azt az egyik társkérelmező egy folyamatban lévő, egészséges és Kawasaki-betegségben szenvedő gyermekeken végzett vizsgálata javasolta (Brogan P et al, ref. közzétett).

40 alany/csoport szükséges ahhoz, hogy 90%-os teljesítménnyel, 0,05-ös szignifikancia mellett a CEC-k megkétszereződő átlagát detektálják CD-ben és UC-ban a kontrollhoz képest, és ez a kezdeti toborzásunkkal elérhető. A nem-normalitás és a nem-paraméteres vagy transzformáció használatának szükségessége az elemzés előtt 47-re növeli a számot; ezért arra törekszünk, hogy 50 főt toborozzanak az UC csoportba. Ez megfelelő teljesítményt biztosít, és a rendelkezésünkre álló klinikai kohorsz alapján megvalósítható.

Ez a betegcsoport megfelelő jelöltcsoport a jelen vizsgálathoz

1. A bizonyítékok azt mutatják, hogy a 10-20 éves kor között fellépő vaszkuláris változások kritikus meghatározói az érrendszer jövőbeli egészségének;
2. A dohányzási szokásokba való beavatás legvalószínűbb tizenéves korban és
3. Az érelmeszesedés egyéb, hagyományos rizikófaktorai (mint például a magas vérnyomás, a II-es típusú cukorbetegség vagy akár a teljesen kialakult atheroscleroticus betegség), amelyek zavaró változóként működnének, még nincsenek jelen serdülőkorban.

Az adatok egy azonosítatlan Excel-lapon kerülnek összegyűjtésre, és tartalmazzák az életkort, a nemet, a diagnózis felállításának korát, a koszorúér állapotát a bemutatáskor, a növekedést, a testtömegindexet, a vérnyomást, a szív- és érrendszeri betegségek családi anamnézisét és a dohányzási állapotot.

1. cél: Van-e bizonyíték az IBD-ben szenvedő gyermekeknél MP által közvetített protrombotikus hajlamra? Az MP-ket áramlási citometriával azonosítjuk, amint azt csoportunk korábban leírta19. Röviden, vérlemezke-szegény plazmát (PPP) nyernek a vérből, és -80 °C-on tárolják a jövőbeni tételes tesztelés céljából. 200 μl PPP lehetővé teszi az MP-k ülepedését, amelyeket az Annexin V (AnV) kötőpufferben újraszuszpendálnak, mielőtt FITC- vagy fikoeritrin-AnV-vel (BD PharMingen) megfestenék. Az endoteliális, thrombocyta és neutrofil eredetű MP-k (EMP-k/PMP-k/NMP-k) és a szöveti faktor (TF) számbavétele anti-humán (CD62E, CD41 és CD11b aktiváló epitóppal, amely rendre az aktivált neutrofilekhez kötődik, valamint a releváns isotípusú kontrollok) történik. ). Latex gyöngyöket (1,1 μm) használnak az 1,1 μm-nél kisebb MP-k bezárására. Az MP-k trombózisos potenciálját úgy határozzuk meg, hogy az MP-ket tripszin inhibitort [gátolja a kontaktaktivációt] tartalmazó kontroll mikrorészecskementes plazmában (MPFP) szuszpendáljuk, majd kalcium-fluorogén szubsztráttal (Z-G-G-R-AMC) tesszük ki. A trombinképződés kinetikáját 90 perccel a stimuláció után rögzítik. Ki kell számítani a perc késleltetési időt, a trombin csúcsértékét nM, a sebességindexet nM/min és az endogén trombinpotenciált (ETP) nM × min. A PS és a TF relatív hozzájárulása az MP által közvetített trombinképződéshez, az MP-ket előinkubáljuk növekvő koncentrációjú rekombináns AnV fehérjével vagy blokkoló anti-TF-vel (vagy izotípus kontrollal) a trombin elemzés előtt.

2. cél. Az IBD-ben szenvedő gyermekeknél van-e bizonyíték az endothel sérülésére? Az artériás egészségi állapot vizsgálata mellett (lent), a CEC-k mérésével számszerűsítjük az érkárosodást. A CEC-ket immunmágneses gyöngy extrakcióval izolálják (nemzetközi konszenzusos protokoll alapján), és Nageotte kamrás/fluoreszcens mikroszkóppal számolják meg. A CEC felsorolását 10 μm-nél nagyobb méretű Ulex-europaeus-lektin fényes sejtekként határozták meg, amelyekhez 5 mágneses gyöngy kapcsolódik19. Az adatokat az EMP adatokkal összefüggésben elemezzük (1. cél), mivel a kombináció betekintést nyújt az endothel sérülés mértékébe IBD-ben a kontrollhoz képest.

3. cél: Az IBD-ben szenvedő gyermekeknek van-e bizonyítékuk strukturális artériás betegségre? Az impulzushullám sebessége (PWV) az artériás szerkezeti egészség mutatója lesz. A VICORDER elemzőszoftver (Skidmore Medical Limited) segítségével a nyomáshullámformákat egyidejűleg két helyen rögzítik (carotis-femoralis);

Cél 4. Milyen összefüggés van a gyulladásos indexek és az érsérülés kialakult mediátorai között? A hs-CRP, a szérum amiloid A (SAA), a TNF-α, az IL-1α, az IL-1β, az IL-6, az MCP-1, a VEGF, az éhgyomri lipidek és az angiopoietin 1/2 szintjei korrelálnak a validált klinikai értékeléssel. betegségaktivitás [Pediatric UC Activity Index20 (PUCAI) és Pediatric CD Activity Index (PCDAI)] a hagyományos markerek (CRP, ESR, D-dimerek és vérlemezkék aktív és inaktív betegségben) mellett. Sok esetben a hagyományos keringő markerek nem korrelálnak az endoszkópos leletekkel aktív betegségben; a nem hagyományos markerek nagyobb érzékenységet mutathatnak a folyamatban lévő aktív gyulladásos betegek kimutatásában.

Módszertan:

1. Klinikai adatgyűjtés: Az alany klinikai adatait a kísérleti vizsgálatban használt papír adatgyűjtési proformából egy azonosítatlan Excel táblázatra gyűjtik össze. Az összegyűjtött klinikai adatok magukban foglalják az életkort, a nemet, az IBD diagnózisának idején, a koszorúér állapotot a bemutatáskor és jelenleg, a növekedést és a testtömeg-indexet, a vérnyomást, a szív- és érrendszeri betegségek családi anamnézisét és a dohányzási állapotot.
2. A krónikus gyulladást a plazma Meso Scale Discovery (MSD, Maryland, USA) többsoros elektrokemilumineszcenciás detektálásával értékelik: hs-CRP, SAA, TNF-α, IL-6, 8 és 10, MCP-1, VEGF, angiopoietin 1 és 2 (ez utóbbi az endothel leválást közvetíti szisztémás vasculitisben (66). Ez a technika lehetővé teszi számos paraméter meghatározását nagyon kis mennyiségű vérből, és (a gyártó utasításai szerint) nagy sikerrel alkalmazták a kísérleti vizsgálatban; d. Az endothel aktiváció/sérülés értékelése a következők szerint történik: a CEC-szám mennyiségileg immunomágneses gyöngy (IB) izolálásával teljes vérből anti-CD146 bevonatú gyöngyökkel, majd FITC-konjugált Ulex-szel megfestve, és fluoreszcens mikroszkóppal és Nageotte számlálókamrával számszerűsítve a korábban leírtak szerint. csoportunk és mások (46;67); A CD105-öt, E-szelektint, ICAM-1-et, VCAM-1 CD144-et, CD31-et expresszáló, de a CD42a vagy CD62P thrombocyta-markerekre negatív EMP-ket a thrombocytaszegény plazmából BD FACSArray áramlási citométerrel határozzuk meg, a csoportunk által korábban leírtak szerint (44). ); e. Az endothel helyreállító potenciált összesen 45 alanynál (mindegyik csoportból 15: KD CAA+, CAA- és egészséges kontrollok) értékelik az (i) EPC kolóniaképző egység (CFU) kapacitásának (68) és (ii) az EPC értékelésével. a HUVEC vaszkuláris struktúráiba való beépülés lehetősége a matrigelben (69), és ma már rutinszerűen elvégzi csoportunk (lásd alább). Az EPC-ket 5 ml vérből izolált PBMC-kből állítják elő, amelyeket humán fibronektinnel bevont tenyészedényekbe szélesztenek, és 20% magzati borjúszérummal és 40 ng/ml VEGF-fel kiegészített EGM-2-ben tartjuk. 4 nap tenyésztés után a nem tapadó sejteket foszfáttal pufferolt sóoldattal történő mosással eltávolítjuk, és a tapadó sejteket a tenyészetben tartjuk a 7. napig. Ezután megszámoljuk a korai EPC telepképző egységeket. A fent leírt módon gyűjtött amplifikált EPC-ket ezután Di-I-LDL-lel jelöljük, majd HUVEC-vel újralemezzük egy megszilárdult matrigel réteg tetején, és 37 °C-on 24 órán át inkubáljuk. Fluoreszcens mikroszkóppal vizsgálják az EPC-k beépülését a HUVEC kapillárisrácsába, és a HUVEC tubulusok képződését (a szélessége négyszeres hosszúságú szerkezet) összehasonlítják a KD-ből (+/- CAA) származó EPC-vel az egészséges kontrollokhoz. Öt független mezőt értékelünk minden egyes lyukhoz, és meghatározzuk a tubulusok átlagos számát/×100 mezőt. f. A vaszkuláris merevséget és a carotis IMT-t a következők szerint kell értékelni: (i) a carotis-femoralis és a carotis-radialis pulzushullám sebessége (PWV) a Vicorder készülék (Skidmore Medical Limited) használatával; Mindezeket a technikákat a csoportunk rutinszerűen elvégzi az AHA ajánlásainak megfelelően (70), amint azt kísérleti adataink és korábban publikált tanulmányaink (71-73) mutatják.