Vaskulær dysfunksjon ved pediatrisk IBD

Undersøkelsesplan:

Pasienter: 130 barn og ungdom (8-21 år) med et forventet forhold på 60 % (n=78) Crohns sykdom (CD), 35 % (n=45) Ulcerøs kolitt (UC) 5 % (n=6) Ubestemt kolitt (IC). 78 alders- og kjønnsmatchede kontroller vil bli undersøkt. Prøvestørrelsesberegninger er basert på sirkulerende endotelceller (CECs) som det primære endepunktet, som foreslått av en pågående studie av en av medsøkerne, på friske barn og barn med Kawasaki sykdom (Brogan P et al, ref. publisert).

Det kreves 40 forsøkspersoner/gruppe for å oppdage et doblingsgjennomsnitt av CEC i CD og UC vs. kontroll med 90 % kraft, signifikans 0,05, og dette bør være oppnåelig ved vår første rekruttering. Ikke-normalitet og behovet for å bruke ikke-parametrisk eller transformasjon før analyse, øker tallet til 47; derfor vil vi sikte på å rekruttere 50 til UC-gruppen. Dette vil gi tilstrekkelig kraft, og er gjennomførbart basert på den kliniske kohorten som er tilgjengelig for oss.

Denne pasientkohorten er en passende kandidatgruppe for denne undersøkelsen som

1. Bevis indikerer at vaskulære endringer som skjer mellom 10-20 år er en kritisk determinant for fremtidig karhelse;
2. Innledning til røykevaner er mest sannsynlig i tenårene og
3. Andre etablerte tradisjonelle risikofaktorer for aterosklerose (som hypertensjon, type II diabetes eller til og med fullt etablert aterosklerotisk sykdom) som vil fungere som forvirrende variabler, er ennå ikke til stede i ungdomsårene.

Data vil bli samlet inn på et avidentifisert excel-ark og vil inkludere alder, kjønn, alder ved diagnose, koronararteriestatus ved presentasjon, vekst, kroppsmasseindeks, blodtrykk, familiehistorie med CVD og røykestatus.

Mål 1: Har barn med IBD tegn på en MP-mediert protrombotisk tendens? Parlamentsmedlemmer vil bli identifisert ved flowcytometri som tidligere beskrevet av vår gruppe19. Kort fortalt vil blodplatefattig plasma (PPP) hentes fra blod og lagres ved -80 °C for fremtidig batchtesting. 200 μL PPP vil tillate sedimentering av MPer som vil bli resuspendert i Annexin V (AnV) bindingsbuffer før farging med FITC- eller phycoerythrin -AnV (BD PharMingen). Endotel-, blodplate- og nøytrofilavledede MPer (EMPs/PMPs/NMPs) og Tissue-Factor (TF) vil bli talt opp ved påvisning med anti-human (CD62E, CD41 og CD11b aktiveringsepitop som binder seg til henholdsvis aktiverte nøytrofiler, pluss relevante isotypekontroller ). Lateksperler (1,1 μm) brukes til å gate MP-er < 1,1 μm. Det trombotiske potensialet til MP-er vil kvantifiseres ved å suspendere MP-er i kontrollmikropartikkelfritt plasma (MPFP) som inneholder trypsinhemmer [hemmer kontaktaktivering] etterfulgt av eksponering for kalsiumfluorogent substrat (Z-G-G-R-AMC). Kinetikk av trombingenerering vil bli registrert opptil 90 minutter etter stimulering. Lagtid min, topp trombin nM, hastighetsindeks nM/min og endogent trombinpotensial (ETP) nM × min vil bli beregnet. For å undersøke det relative bidraget til PS og TF til MP-mediert trombingenerering, vil MP-er pre-inkuberes med økende konsentrasjoner av rekombinant AnV-protein eller en blokkerende anti-TF (eller isotypekontroll) før trombinanalyse.

Mål 2. Har barn med IBD tegn på endotelskade? I tillegg til å undersøke arteriell helse (nedenfor), vil vi kvantifisere vaskulær skade ved å måle CEC. CEC-er vil bli isolert ved immunomagnetisk perleekstraksjon (basert på en internasjonal konsensusprotokoll) og telles ved hjelp av et Nageotte-kammer/fluorescensmikroskopi. CEC-oppregning er definert som Ulex-europaeus-lectin lyse celler på >10 μm i størrelse, med 5 magnetiske perler festet19. Data vil bli analysert i sammenheng med EMP-data (Mål 1) da kombinasjonen vil gi et innblikk i graden av endotelskade ved IBD versus kontroll.

Mål 3. Har barn med IBD tegn på strukturell arteriell sykdom? Pulse Wave Velocity (PWV) vil være en indikator på arteriell strukturell helse. Trykkbølgeformer vil bli registrert samtidig på to steder (carotis-femoral) ved hjelp av VICORDER-analyseprogramvaren (Skidmore Medical Limited);

Mål 4. Hva er forholdet mellom inflammasjonsindekser og etablerte mediatorer av vaskulær skade? Nivåer av hs-CRP, serumamyloid A (SAA), TNF-α, IL-1α, IL-1β, IL-6, MCP-1, VEGF, fastende lipider og angiopoietin 1/2 vil være korrelert med validert klinisk vurdering av sykdomsaktivitet [Paediatric UC Activity Index20 (PUCAI) & Pediatric CD Activity Index (PCDAI)] i tillegg til konvensjonelle markører (CRP, ESR, D-Dimers og blodplater ved aktiv og inaktiv sykdom). I mange tilfeller korrelerer ikke konvensjonelle sirkulerende markører med endoskopiske funn ved aktiv sykdom; de ikke-konvensjonelle markørene kan vise en høyere følsomhet ved å oppdage de med pågående aktiv betennelse.

Metodikk:

1. Klinisk datainnsamling: Kliniske data fra emnet vil bli samlet på et avidentifisert Excel-regneark fra en papirdatainnsamlingsproforma som ble brukt i pilotstudien. Kliniske data som samles inn vil inkludere alder, kjønn, alder ved IBD-diagnose, koronararteriestatus ved presentasjon og for tiden, vekst og kroppsmasseindeks, blodtrykk, familiehistorie med kardiovaskulær sykdom og røykestatus.
2. Kronisk betennelse vil bli vurdert ved hjelp av Meso Scale Discovery (MSD, Maryland, USA) multi-array elektrokjemiluminescensdeteksjon av plasma: hs-CRP, SAA, TNF-α, IL-6, 8 og 10, MCP-1, VEGF, angiopoietin 1 og 2 (sistnevnte medierer endotelløsning ved systemisk vaskulitt (66). Denne teknikken gjør det mulig å analysere mange parametere fra svært små mengder blod og ble brukt (i henhold til produsentens instruksjoner) med stor suksess i pilotstudien; d. Endotelaktivering/skade vil bli vurdert ved: CEC-tall kvantifisert ved immunomagnetisk perle (IB) isolasjon fra fullblod ved bruk av anti-CD146-belagte perler, deretter farget med FITC-konjugert Ulex og oppregnet ved bruk av fluorescerende mikroskopi og et Nageotte-tellekammer som tidligere beskrevet av vår gruppe og andre (46;67); EMP-er som uttrykker CD105, E-selektin, ICAM-1, VCAM-1 CD144, CD31, men negative for blodplatemarkørene CD42a eller CD62P, vil kvantifiseres fra blodplatefattig plasma ved bruk av et BD FACSArray flowcytometer som tidligere beskrevet av vår gruppe (44) ); e. Endotelreparasjonspotensialet vil bli vurdert i totalt 45 forsøkspersoner (15 fra hver gruppe: KD CAA+, CAA- og friske kontroller) ved å vurdere (i) EPC kolonidannende enhet (CFU) kapasitet (68), og (ii) EPC potensial til å inkorporere i HUVEC vaskulære strukturer i matrigel (69), og nå rutinemessig utført av vår gruppe (se nedenfor). EPC-er er fremstilt fra PBMC-er isolert fra 5 ml blod, blir sådd ut i kulturskåler belagt med humant fibronektin og opprettholdt i EGM-2 supplert med 20 % føtalt kalveserum og 40 ng/ml VEGF. Etter 4 dager i kultur fjernes ikke-adherente celler ved å vaske med fosfatbufret saltvann og de adherente cellene holdes i kultur til dag 7. Tidlige EPC-kolondiannende enheter telles deretter. Amplifiserte EPC-er høstet som beskrevet ovenfor merkes deretter med Di-I-LDL og utplates på nytt med HUVEC på toppen av et størknet matrigellag og inkuberes ved 37 °C i 24 timer. Fluorescensmikroskopi brukes til å vurdere inkorporering av EPC-er i HUVEC-kapillærgitteret, og HUVEC-tubulidannelse (struktur som viser lengde fire ganger bredden) vil bli sammenlignet ved bruk av EPC fra KD (+/- CAA) med friske kontroller. Fem uavhengige felt vurderes for hver brønn, og gjennomsnittlig antall tubuli/×100 felt bestemmes. f. Vaskulær stivhet og carotis IMT vil bli vurdert ved: (i) carotis-femoral og carotid-radial pulsbølgehastighet (PWV) ved å bruke Vicorder-enheten (Skidmore Medical Limited); Alle disse teknikkene utføres rutinemessig av vår gruppe i samsvar med AHA-anbefalingene (70), som illustrert av våre pilotdata og våre tidligere publiserte studier (71-73).