Vaskulær dysfunktion ved pædiatrisk IBD

Undersøgelsesplan:

Patienter: 130 børn og unge (8-21 år) med et forventet forhold på 60% (n=78) Crohns sygdom (CD), 35% (n=45) Colitis ulcerosa (UC) 5% (n=6) Ubestemt colitis (IC). 78 alders- og kønsmatchede kontroller vil blive undersøgt. Prøvestørrelsesberegninger er baseret på cirkulerende endotelceller (CEC'er) som det primære endepunkt, som foreslået af en igangværende undersøgelse foretaget af en af ​​medansøgerne, på raske børn og børn med Kawasaki sygdom (Brogan P et al, ref. offentliggjort).

Der kræves 40 forsøgspersoner/gruppe for at detektere et fordobling af gennemsnittet af CEC'er i CD og UC vs. kontrol med 90% power, signifikans 0,05, og dette burde være opnåeligt ved vores indledende rekruttering. Ikke-normalitet og behovet for at bruge ikke-parametrisk eller transformation før analyse, øger tallet til 47; derfor vil vi sigte mod at rekruttere 50 til UC-gruppen. Dette vil give tilstrækkelig kraft og er gennemførligt baseret på den kliniske kohorte, der er tilgængelig for os.

Denne patientkohorte er en passende kandidatgruppe til nærværende undersøgelse som

1. Evidens tyder på, at vaskulære ændringer, der forekommer mellem 10-20 års alderen, er en kritisk determinant for fremtidig karsundhed;
2. Indledning til rygevaner er højst sandsynligt i teenageår og
3. Andre etablerede traditionelle risikofaktorer for åreforkalkning (såsom hypertension, type II-diabetes eller endda fuldt etableret aterosklerotisk sygdom), der ville fungere som forvirrende variabler, er endnu ikke til stede i ungdomsårene.

Data vil blive samlet på et afidentificeret excel-ark og vil omfatte alder, køn, alder ved diagnose, koronararteriestatus ved præsentation, vækst, body mass index, blodtryk, familiehistorie med CVD og rygestatus.

Mål 1: Har børn med IBD tegn på en MP-medieret protrombotisk tendens? MP'er vil blive identificeret ved flowcytometri som tidligere beskrevet af vores gruppe19. Kort fortalt vil blodpladefattigt plasma (PPP) blive opnået fra blod og opbevaret ved -80 °C til fremtidig batchtest. 200 μL PPP vil tillade sedimentering af MP'er, som vil blive resuspenderet i Annexin V (AnV) bindingsbuffer før farvning med FITC- eller phycoerythrin-AnV (BD PharMingen). Endotel-, blodplade- og neutrofilafledte MP'er (EMP'er/PMP'er/NMP'er) og Tissue-Factor (TF'er) vil blive opregnet ved påvisning med anti-human (CD62E, CD41 og CD11b aktiveringsepitop, som binder til henholdsvis aktiverede neutrofiler plus relevante isotypekontroller ). Latexperler (1,1 μm) bruges til at gate MP'er < 1,1 μm. Det trombotiske potentiale af MP'er vil blive kvantificeret ved at suspendere MP'er i kontrol mikropartikelfrit plasma (MPFP) indeholdende trypsinhæmmer [hæmmer kontaktaktivering] efterfulgt af eksponering for calciumfluorogent substrat (Z-G-G-R-AMC). Kinetikken af ​​thrombingenerering vil blive registreret op til 90 minutter efter stimulering. Lagtid min, peak thrombin nM, hastighedsindeks nM/min og endogent thrombin potentiale (ETP) nM × min vil blive beregnet. For at undersøge det relative bidrag fra PS og TF til MP-medieret thrombingenerering, vil MP'er blive præ-inkuberet med stigende koncentrationer af rekombinant AnV-protein eller en blokerende anti-TF (eller isotypekontrol) før thrombinanalyse.

Mål 2. Har børn med IBD tegn på endotelskade? Ud over at undersøge arteriel sundhed (nedenfor) vil vi kvantificere vaskulær skade ved at måle CEC'er. CEC'er vil blive isoleret ved immunomagnetisk perleekstraktion (baseret på en international konsensusprotokol) og talt ved hjælp af en Nageotte-kammer/fluorescensmikroskopi. CEC-optælling er defineret som Ulex-europaeus-lectin lyse celler på >10 μm i størrelse, med 5 magnetiske perler vedhæftet19. Data vil blive analyseret i sammenhæng med EMP-data (Mål 1), da kombinationen vil give et indblik i graden af ​​endotelskade i IBD versus kontrol.

Mål 3. Har børn med IBD tegn på strukturel arteriel sygdom? Pulse Wave Velocity (PWV) vil være en indikator for arteriel strukturel sundhed. Trykbølgeformer vil blive optaget samtidigt på to steder (carotis-femoral) ved hjælp af VICORDER-analysesoftwaren (Skidmore Medical Limited);

Mål 4. Hvad er sammenhængen mellem inflammationsindekser og etablerede mediatorer af vaskulær skade? Niveauer af hs-CRP, serumamyloid A (SAA), TNF-α, IL-1α, IL-1β, IL-6, MCP-1, VEGF, fastende lipider og angiopoietin 1/2 vil være korreleret med valideret klinisk vurdering af sygdomsaktivitet [Pediatric UC Activity Index20 (PUCAI) & Pediatric CD Activity Index (PCDAI)] foruden konventionelle markører (CRP, ESR, D-Dimerer og blodplader ved aktiv og inaktiv sygdom). I mange tilfælde korrelerer konventionelle cirkulerende markører ikke med endoskopiske fund ved aktiv sygdom; de ikke-konventionelle markører kan vise en højere følsomhed ved påvisning af personer med igangværende aktiv inflammation.

Metode:

1. Klinisk dataindsamling: Kliniske data fra emnet vil blive samlet på et afidentificeret excel-regneark fra en papirdataindsamlingsproforma som brugt i pilotstudiet. De indsamlede kliniske data vil omfatte alder, køn, alder ved IBD-diagnose, koronararteriestatus ved præsentation og aktuelt, vækst og kropsmasseindeks, blodtryk, familiehistorie med kardiovaskulær sygdom og rygestatus.
2. Kronisk inflammation vil blive vurderet ved hjælp af Meso Scale Discovery (MSD, Maryland, USA) multi-array elektrokemiluminescensdetektion af plasma: hs-CRP, SAA, TNF-α, IL-6, 8 og 10, MCP-1, VEGF, angiopoietin 1 og 2 (sidstnævnte medierer endotelløsning ved systemisk vaskulitis (66). Denne teknik gør det muligt at analysere mange parametre fra meget små mængder blod og blev brugt (i henhold til producentens instruktioner) med stor succes i pilotundersøgelsen; d. Endotelaktivering/beskadigelse vil blive vurderet ved: CEC-tal kvantificeret ved immunomagnetisk perle (IB) isolering fra fuldblod ved hjælp af anti-CD146 coatede perler, derefter farvet med FITC-konjugeret Ulex og talt ved hjælp af fluorescensmikroskopi og et Nageotte tællekammer som tidligere beskrevet af vores gruppe og andre (46;67); EMP'er, der udtrykker CD105, E-selectin, ICAM-1, VCAM-1 CD144, CD31, men negative for blodplademarkørerne CD42a eller CD62P, vil blive kvantificeret fra blodpladefattigt plasma ved hjælp af et BD FACSArray flowcytometer som tidligere beskrevet af vores gruppe (44) ); e. Endothelial reparationspotentiale vil blive vurderet i i alt 45 forsøgspersoner (15 fra hver gruppe: KD CAA+, CAA- og raske kontroller) ved at vurdere (i) EPC kolonidannende enheds (CFU) kapacitet (68) og (ii) EPC potentiale til at inkorporere i HUVEC vaskulære strukturer i matrigel (69), og nu rutinemæssigt udført af vores gruppe (se nedenfor). EPC'er fremstilles ud fra PBMC'er, der er isoleret fra 5 ml blod, udplades i kulturskåle overtrukket med humant fibronectin og holdes i EGM-2 suppleret med 20 % føtalt kalveserum og 40 ng/ml VEGF. Efter 4 dage i kultur fjernes ikke-adhærente celler ved vask med phosphatbufret saltvand, og de adhærente celler holdes i kultur indtil dag 7. Tidlige EPC kolonidannende enheder tælles derefter. Amplificerede EPC'er høstet som beskrevet ovenfor mærkes derefter med Di-I-LDL og genudplades med HUVEC på toppen af ​​et størknet matrigellag og inkuberes ved 37 °C i 24 timer. Fluorescensmikroskopi bruges til at vurdere inkorporering af EPC'er i HUVEC kapillærgitteret, og HUVEC-tubulidannelse (struktur, der udviser længde fire gange bredden) vil blive sammenlignet ved brug af EPC fra KD (+/- CAA) med raske kontroller. Fem uafhængige felter vurderes for hver brønd, og det gennemsnitlige antal tubuli/×100 felt bestemmes. f. Vaskulær stivhed og carotis IMT vil blive vurderet ved: (i) carotis-femoral og carotis-radial pulsbølgehastighed (PWV) ved hjælp af Vicorder-enheden (Skidmore Medical Limited); Alle disse teknikker udføres rutinemæssigt af vores gruppe i overensstemmelse med AHA-anbefalinger (70), som illustreret af vores pilotdata og vores tidligere publicerede undersøgelser (71-73).