Dysfonction vasculaire dans les MII pédiatriques

Plan d'enquête :

Patients : 130 enfants et adolescents (8-21 ans) avec un ratio attendu de 60 % (n = 78) Maladie de Crohn (MC), 35 % (n = 45) Colite ulcéreuse (CU) 5 % (n = 6) Colite indéterminée (IC). 78 témoins appariés selon l'âge et le sexe seront étudiés. Les calculs de la taille de l'échantillon sont basés sur les cellules endothéliales circulantes (CEC) comme critère principal, comme suggéré par une étude en cours par l'un des co-demandeurs, sur des enfants en bonne santé et des enfants atteints de la maladie de Kawasaki (Brogan P et al, réf. publié).

40 sujets / groupe sont nécessaires pour détecter une moyenne double des CEC dans CD et UC par rapport au contrôle avec une puissance de 90 %, une signification de 0,05 et cela devrait être réalisable par notre recrutement initial. La non-normalité et la nécessité d'utiliser des transformations non paramétriques avant l'analyse augmentent le nombre à 47 ; nous visons donc à en recruter 50 dans le groupe UC. Cela fournira une puissance adéquate et est faisable en fonction de la cohorte clinique dont nous disposons.

Cette cohorte de patients est un groupe candidat approprié pour la présente enquête car

1. Les preuves indiquent que les changements vasculaires qui se produisent entre 10 et 20 ans sont un déterminant essentiel de la santé vasculaire future ;
2. L'initiation à l'habitude de fumer est plus probable à l'adolescence et
3. D'autres facteurs de risque traditionnels établis pour l'athérosclérose (tels que l'hypertension, le diabète de type II ou même une maladie athéroscléreuse complètement établie) qui agiraient comme des variables confondantes ne sont pas encore présents à l'adolescence.

Les données seront rassemblées sur une feuille Excel anonymisée et comprendront l'âge, le sexe, l'âge au moment du diagnostic, l'état de l'artère coronaire lors de la présentation, la croissance, l'indice de masse corporelle, la tension artérielle, les antécédents familiaux de MCV et le statut tabagique.

Objectif 1 : Les enfants atteints de MII présentent-ils des signes de tendance prothrombotique médiée par MP ? Les députés seront identifiés par cytométrie en flux comme décrit précédemment par notre groupe19. En bref, le plasma pauvre en plaquettes (PPP) sera obtenu à partir de sang et stocké à -80 ° C pour les futurs tests par lots. 200 μL de PPP permettront la sédimentation des MP qui seront remis en suspension dans un tampon de liaison à l'annexine V (AnV) avant la coloration avec FITC- ou phycoérythrine -AnV (BD PharMingen). Les MP dérivés de l'endothélium, des plaquettes et des neutrophiles (EMP/PMP/NMP) et le facteur tissulaire (TF) seront dénombrés par détection avec des épitopes d'activation anti-humains (CD62E, CD41 et CD11b qui se lient respectivement aux neutrophiles activés, plus les contrôles d'isotype pertinents ). Des billes de latex (1,1 μm) sont utilisées pour bloquer les MP < 1,1 μm. Le potentiel thrombotique des MP sera quantifié en suspendant les MP dans un plasma témoin sans microparticules (MPFP) contenant un inhibiteur de la trypsine [inhibe l'activation par contact], suivi d'une exposition à un substrat calcium-fluorogénique (Z-G-G-R-AMC). La cinétique de génération de thrombine sera enregistrée jusqu'à 90 minutes après la stimulation. Le temps de latence min, le pic de thrombine nM, l'indice de vitesse nM/min et le potentiel de thrombine endogène (ETP) nM × min seront calculés. Pour étudier la contribution relative de PS et TF à la génération de thrombine médiée par MP, les MP seront pré-incubés avec des concentrations croissantes de protéine AnV recombinante ou un anti-TF bloquant (ou isotype contrôle) avant l'analyse de la thrombine.

Objectif 2. Les enfants atteints de MICI présentent-ils des signes de lésion endothéliale ? En plus d'étudier la santé artérielle (ci-dessous), nous quantifierons les lésions vasculaires en mesurant les CEC. Les CEC seront isolées par extraction de billes immunomagnétiques (basée sur un protocole de consensus international) et comptées à l'aide d'une chambre de Nageotte/microscopie à fluorescence. Le dénombrement des CEC est défini comme des cellules lumineuses Ulex-europaeus-lectine de taille > 10 μm, avec 5 billes magnétiques attachées19. Les données seront analysées dans le contexte des données EMP (Objectif 1) car la combinaison donnera un aperçu du degré de lésion endothéliale dans les MICI par rapport au contrôle.

Objectif 3. Les enfants atteints de MII présentent-ils des signes de maladie artérielle structurelle ? La vitesse de l'onde de pouls (PWV) sera un indicateur de la santé structurelle artérielle. Les formes d'onde de pression seront enregistrées simultanément sur deux sites (carotide-fémoral) à l'aide du logiciel d'analyse VICORDER (Skidmore Medical Limited) ;

Objectif 4. Quelle est la relation entre les indices d'inflammation et les médiateurs établis des lésions vasculaires ? Les niveaux de hs-CRP, d'amyloïde A sérique (SAA), de TNF-α, d'IL-1α, d'IL-1β, d'IL-6, de MCP-1, de VEGF, de lipides à jeun et d'angiopoïétine 1/2 seront corrélés avec une évaluation clinique validée de activité de la maladie [Pediatric UC Activity Index20 (PUCAI) & Pediatric CD Activity Index (PCDAI)] en plus des marqueurs conventionnels (CRP, ESR, D-Dimers et plaquettes dans les maladies actives et inactives). Dans de nombreux cas, les marqueurs circulants conventionnels ne sont pas corrélés aux résultats endoscopiques dans la maladie active ; les marqueurs non conventionnels peuvent montrer une plus grande sensibilité dans la détection des personnes présentant une inflammation active continue.

Méthodologie:

1. Collecte de données cliniques : les données cliniques du sujet seront rassemblées sur une feuille de calcul Excel anonymisée à partir d'un formulaire papier de collecte de données tel qu'utilisé dans l'étude pilote. Les données cliniques recueillies comprendront l'âge, le sexe, l'âge au moment du diagnostic de MICI, l'état de l'artère coronaire au moment de la présentation et actuellement, la croissance et l'indice de masse corporelle, la pression artérielle, les antécédents familiaux de maladie cardiovasculaire et le statut tabagique.
2. L'inflammation chronique sera évaluée à l'aide de la détection par électrochimiluminescence multi-réseaux de Meso Scale Discovery (MSD, Maryland, États-Unis) du plasma : hs-CRP, SAA, TNF-α, IL-6, 8 et 10, MCP-1, VEGF, angiopoïétine 1 et 2 (ce dernier médiant le détachement endothélial dans la vascularite systémique (66). Cette technique permet de doser de nombreux paramètres à partir de très petites quantités de sang et a été utilisée (selon les instructions du fabricant) avec beaucoup de succès dans l'étude pilote ; d. L'activation/les lésions endothéliales seront évaluées par : le nombre de CEC quantifié par isolement par billes immunomagnétiques (IB) du sang total à l'aide de billes revêtues d'anti-CD146, puis colorées avec Ulex conjugué au FITC et dénombrées à l'aide d'une microscopie à fluorescence et d'une chambre de comptage Nageotte comme décrit précédemment par notre groupe et d'autres (46;67); Les EMP exprimant CD105, E-sélectine, ICAM-1, VCAM-1 CD144, CD31, mais négatifs pour les marqueurs plaquettaires CD42a ou CD62P seront quantifiés à partir de plasma pauvre en plaquettes à l'aide d'un cytomètre en flux BD FACSArray comme décrit précédemment par notre groupe (44 ); e. Le potentiel de réparation endothéliale sera évalué chez un total de 45 sujets (15 de chaque groupe : KD CAA+, CAA- et témoins sains) en évaluant (i) la capacité de l'unité de formation de colonies (UFC) EPC (68) et (ii) l'EPC potentiel d'incorporation dans les structures vasculaires HUVEC dans le matrigel (69), et maintenant effectué en routine par notre groupe (voir ci-dessous). Les EPC sont préparés à partir de PBMC isolés de 5 ml de sang sont étalés dans des boîtes de culture enduites de fibronectine humaine et maintenues dans EGM-2 additionné de 20 % de sérum de veau fœtal et de 40 ng/ml de VEGF. Après 4 jours de culture, les cellules non adhérentes sont éliminées par lavage avec une solution saline tamponnée au phosphate et les cellules adhérentes sont maintenues en culture jusqu'au jour 7. Les unités formant des colonies EPC précoces sont ensuite comptées. Les EPC amplifiés récoltés comme décrit ci-dessus sont ensuite marqués avec Di -I-LDL et replaqués avec HUVEC au-dessus d'une couche de matrigel solidifiée et incubés à 37 ° C pendant 24 h. La microscopie fluorescente est utilisée pour évaluer l'incorporation d'EPC dans le réseau capillaire HUVEC, et la formation de tubules HUVEC (structure présentant une longueur quatre fois sa largeur) sera comparée à l'aide d'EPC de KD (+/- CAA) à des témoins sains. Cinq champs indépendants sont évalués pour chaque puits, et le nombre moyen de tubules/×100 champ est déterminé. F. La rigidité vasculaire et l'IMT carotidienne seront évaluées par : (i) la vitesse de l'onde de pouls carotido-fémorale et carotidienne-radiale (PWV) à l'aide du dispositif Vicorder (Skidmore Medical Limited) ; Toutes ces techniques sont pratiquées en routine par notre groupe conformément aux recommandations de l'AHA (70), comme l'illustrent nos données pilotes et nos études précédemment publiées (71-73).