Disfunción vascular en la EII pediátrica

Plan de Investigación:

Pacientes: 130 niños y adolescentes (8-21 años) con ratio esperado 60% (n=78) Enfermedad de Crohn (EC), 35% (n=45) Colitis ulcerosa (CU) 5% (n=6) Colitis indeterminada (CI). Se investigarán 78 controles emparejados por edad y sexo. Los cálculos del tamaño de la muestra se basan en las células endoteliales circulantes (CEC) como criterio principal de valoración, como sugiere un estudio en curso realizado por uno de los cosolicitantes, en niños sanos y niños con la enfermedad de Kawasaki (Brogan P et al, ref. publicado).

Se requieren 40 sujetos/grupo para detectar un promedio de duplicación de CEC en CD y UC frente al control con una potencia del 90 %, significación 0,05 y esto debería ser posible con nuestro reclutamiento inicial. La no normalidad y la necesidad de utilizar métodos no paramétricos o transformados antes del análisis aumenta el número a 47; por lo tanto, intentaremos reclutar 50 para el grupo UC. Esto proporcionará el poder adecuado y es factible en función de la cohorte clínica disponible para nosotros.

Esta cohorte de pacientes es un grupo candidato apropiado para la presente investigación, ya que

1. La evidencia indica que los cambios vasculares que ocurren entre los 10 y los 20 años de edad son un determinante crítico de la salud vascular futura;
2. La iniciación al hábito tabáquico es más probable en la adolescencia y
3. Otros factores de riesgo tradicionales establecidos para la aterosclerosis (como la hipertensión, la diabetes tipo II o incluso la enfermedad aterosclerótica completamente establecida) que actuarían como variables de confusión, aún no están presentes en la adolescencia.

Los datos se recopilarán en una hoja de Excel anónima e incluirán la edad, el sexo, la edad en el momento del diagnóstico, el estado de la arteria coronaria en el momento de la presentación, el crecimiento, el índice de masa corporal, la presión arterial, los antecedentes familiares de ECV y el tabaquismo.

Objetivo 1: ¿Los niños con EII tienen evidencia de una tendencia protrombótica mediada por MP? Los MP se identificarán por citometría de flujo como se describió previamente por nuestro grupo19. Brevemente, el plasma pobre en plaquetas (PPP) se obtendrá de la sangre y se almacenará a -80 °C para futuras pruebas por lotes. 200 μL de PPP permitirán la sedimentación de MP que se resuspenderán en tampón de unión de anexina V (AnV) antes de la tinción con FITC o ficoeritrina-AnV (BD PharMingen). Los MP derivados del endotelio, las plaquetas y los neutrófilos (EMP, PMP, NMP) y el factor tisular (TF) se enumerarán mediante detección con epítopo de activación antihumano (CD62E, CD41 y CD11b que se une a los neutrófilos activados respectivamente, además de controles de isotipo relevantes). ). Se utilizan perlas de látex (1,1 μm) para filtrar MP < 1,1 μm. El potencial trombótico de las MP se cuantificará mediante la suspensión de las MP en plasma libre de micropartículas (MPFP) de control que contiene inhibidor de tripsina [inhibe la activación por contacto] seguido de la exposición al sustrato fluorogénico de calcio (Z-G-G-R-AMC). La cinética de la generación de trombina se registrará hasta 90 minutos después de la estimulación. Se calculará el tiempo de latencia min, la trombina máxima nM, el índice de velocidad nM/min y el potencial de trombina endógena (ETP) nM × min. Para investigar la contribución relativa de PS y TF a la generación de trombina mediada por MP, las MP se incubarán previamente con concentraciones crecientes de proteína AnV recombinante o un anti-TF bloqueante (o control de isotipo) antes del análisis de trombina.

Objetivo 2. ¿Los niños con EII tienen evidencia de daño endotelial? Además de investigar la salud arterial (abajo), cuantificaremos la lesión vascular midiendo las CEC. Las CEC se aislarán mediante extracción con microesferas inmunomagnéticas (basadas en un protocolo de consenso internacional) y se contarán utilizando una cámara de Nageotte/microscopía de fluorescencia. La enumeración de CEC se define como células brillantes de Ulex-europaeus-lectina de >10 μm de tamaño, con 5 perlas magnéticas adheridas19. Los datos se analizarán en el contexto de los datos de EMP (objetivo 1), ya que la combinación dará una idea del grado de lesión endotelial en la EII frente al control.

Objetivo 3. ¿Los niños con EII tienen evidencia de Enfermedad Arterial Estructural? La velocidad de la onda del pulso (PWV) será un indicador de la salud estructural arterial. Las formas de onda de presión se registrarán simultáneamente en dos sitios (carotídeo-femoral) utilizando el software de análisis VICORDER (Skidmore Medical Limited);

Objetivo 4. ¿Cuál es la relación entre índices de inflamación y mediadores establecidos de Lesión vascular? Los niveles de hs-CRP, suero amiloide A (SAA), TNF-α, IL-1α, IL-1β, IL-6, MCP-1, VEGF, lípidos en ayunas y angiopoyetina 1/2 se correlacionarán con la evaluación clínica validada de actividad de la enfermedad [índice de actividad de CU pediátrica20 (PUCAI) e índice de actividad de EC pediátrica (PCDAI)] además de marcadores convencionales (CRP, ESR, D-Dimers y plaquetas en enfermedad activa e inactiva). En muchos casos, los marcadores circulantes convencionales no se correlacionan con los hallazgos endoscópicos en la enfermedad activa; los marcadores no convencionales pueden mostrar una mayor sensibilidad en la detección de aquellos con inflamación activa en curso.

Metodología:

1. Recopilación de datos clínicos: los datos clínicos de los sujetos se cotejarán en una hoja de cálculo de Excel anonimizada de un formulario de recopilación de datos en papel como se usa en el estudio piloto. Los datos clínicos recopilados incluirán la edad, el sexo, la edad en el momento del diagnóstico de la EII, el estado de las arterias coronarias en el momento de la presentación y en la actualidad, el crecimiento y el índice de masa corporal, la presión arterial, los antecedentes familiares de enfermedades cardiovasculares y el tabaquismo.
2. La inflamación crónica se evaluará mediante la detección de plasma por electroquimioluminiscencia de matriz múltiple Meso Scale Discovery (MSD, Maryland, EE. UU.): hs-CRP, SAA, TNF-α, IL-6, 8 y 10, MCP-1, VEGF, angiopoyetina 1 y 2 (este último mediando el desprendimiento endotelial en la vasculitis sistémica (66). Esta técnica permite analizar muchos parámetros a partir de cantidades muy pequeñas de sangre y se utilizó (según las instrucciones del fabricante) con gran éxito en el estudio piloto; d. La activación/lesión endotelial se evaluará mediante: Recuento de CEC cuantificado mediante aislamiento de microesferas inmunomagnéticas (IB) de sangre total utilizando microesferas recubiertas de anti-CD146, luego teñidas con Ulex conjugado con FITC y enumeradas mediante microscopía fluorescente y una cámara de recuento de Nageotte como se describió anteriormente por nuestro grupo y otros (46;67); Los EMP que expresan CD105, E-selectina, ICAM-1, VCAM-1 CD144, CD31, pero negativos para los marcadores de plaquetas CD42a o CD62P se cuantificarán a partir de plasma pobre en plaquetas utilizando un citómetro de flujo BD FACSArray como se describió previamente por nuestro grupo (44). ); mi. El potencial de reparación endotelial se evaluará en un total de 45 sujetos (15 de cada grupo: KD CAA+, CAA- y controles sanos) evaluando (i) la capacidad de la unidad formadora de colonias (CFU) de EPC (68), y (ii) EPC potencial para incorporar en estructuras vasculares HUVEC en matrigel (69), y ahora realizado de forma rutinaria por nuestro grupo (ver más abajo). Las EPC se preparan a partir de PBMC aisladas de 5 ml de sangre que se sembraron en placas de cultivo recubiertas con fibronectina humana y se mantuvieron en EGM-2 complementado con suero de ternero fetal al 20 % y 40 ng/ml de VEGF. Después de 4 días en cultivo, las células no adherentes se eliminan mediante lavado con solución salina tamponada con fosfato y las células adherentes se mantienen en cultivo hasta el día 7. A continuación, se cuentan las unidades formadoras de colonias EPC tempranas. A continuación, las EPC amplificadas recogidas como se ha descrito anteriormente se marcan con Di-I-LDL y se vuelven a sembrar con HUVEC encima de una capa de matrigel solidificada y se incuban a 37 °C durante 24 h. La microscopía fluorescente se usa para evaluar la incorporación de EPC en la red capilar HUVEC, y la formación de túbulos HUVEC (estructura que exhibe una longitud cuatro veces su ancho) se comparará usando EPC de KD (+/- CAA) con controles sanos. Se evalúan cinco campos independientes para cada pocillo y se determina el número medio de túbulos/x100 de campo. F. La rigidez vascular y el IMT carotídeo se evaluarán mediante: (i) la velocidad de la onda del pulso carotídeo-femoral y carotídeo-radial (PWV) utilizando el dispositivo Vicorder (Skidmore Medical Limited); Nuestro grupo realiza de forma rutinaria todas estas técnicas de acuerdo con las recomendaciones de la AHA (70), como lo ilustran nuestros datos piloto y nuestros estudios publicados previamente (71-73).