Сосудистая дисфункция при ВЗК у детей

План расследования:

Пациенты: 130 детей и подростков (8–21 год) с ожидаемым соотношением 60% (n=78) Болезнь Крона (БК) 35% (n=45) Язвенный колит (ЯК) 5% (n=6) Неопределенный колит (IC). Будут исследованы 78 контрольных животных того же возраста и пола. Расчеты размера выборки основаны на циркулирующих эндотелиальных клетках (ЦИК) в качестве первичной конечной точки, как это было предложено в ходе продолжающегося исследования одного из созаявителей на здоровых детях и детях с болезнью Кавасаки (Brogan P et al., ссылка опубликовано).

40 субъектов/группу требуется для обнаружения удвоения среднего числа ЦИК при БК и ЯК по сравнению с контролем с мощностью 90%, значимостью 0,05, и это должно быть достижимо при нашем первоначальном наборе. Ненормальность и необходимость использования непараметрических или преобразований перед анализом увеличивает число до 47; следовательно, мы будем стремиться набрать 50 человек в группу UC. Это обеспечит адекватную мощность и осуществимо на основе доступной нам клинической когорты.

Эта когорта пациентов является подходящей группой-кандидатом для настоящего исследования, поскольку

1. Имеющиеся данные свидетельствуют о том, что сосудистые изменения, происходящие в возрасте 10–20 лет, являются решающим фактором, определяющим здоровье сосудистой системы в будущем;
2. Привыкание к курению наиболее вероятно в подростковом возрасте и
3. Другие установленные традиционные факторы риска атеросклероза (такие как артериальная гипертензия, диабет II типа или даже полностью установленное атеросклеротическое заболевание), которые могли бы действовать как смешанные переменные, еще не присутствуют в подростковом возрасте.

Данные будут сопоставлены на деидентифицированном листе Excel и будут включать возраст, пол, возраст на момент постановки диагноза, состояние коронарной артерии при поступлении, рост, индекс массы тела, артериальное давление, семейный анамнез сердечно-сосудистых заболеваний и статус курения.

Цель 1: Есть ли у детей с ВЗК признаки протромботической тенденции, опосредованной МП? MP будут идентифицированы с помощью проточной цитометрии, как описано ранее нашей группой19. Вкратце, бедная тромбоцитами плазма (PPP) будет получена из крови и храниться при температуре -80 ° C для будущих испытаний партии. 200 мкл PPP позволит седиментировать MP, которые будут ресуспендированы в буфере для связывания аннексина V (AnV) перед окрашиванием FITC- или фикоэритрин-AnV (BD PharMingen). Эндотелиальные, тромбоцитарные и нейтрофильные MP (EMP/PMP/NMP) и тканевой фактор (TF) будут подсчитываться путем обнаружения античеловеческого (CD62E, CD41 и CD11b активационного эпитопа, который связывается с активированными нейтрофилами соответственно, плюс соответствующие изотипические контроли). ). Латексные шарики (1,1 мкм) используются для ворот MP < 1,1 мкм. Тромботический потенциал МЧ будет количественно оцениваться путем суспендирования МЧ в контрольной плазме, не содержащей микрочастиц (MPFP), содержащей ингибитор трипсина [ингибирует контактную активацию], с последующим воздействием кальций-флуорогенного субстрата (Z-G-G-R-AMC). Кинетика образования тромбина будет зарегистрирована до 90 минут после стимуляции. Будут рассчитаны лаг-время мин, пиковый тромбин, нМ, индекс скорости, нМ/мин, и эндогенный тромбиновый потенциал (ЭТП), нМ × мин. Чтобы исследовать относительный вклад PS и TF в опосредованное MP образование тромбина, MP будут предварительно инкубировать с возрастающими концентрациями рекомбинантного белка AnV или блокирующим анти-TF (или изотипическим контролем) перед анализом тромбина.

Цель 2. Есть ли у детей с ВЗК признаки повреждения эндотелия? В дополнение к исследованию состояния артерий (ниже) мы будем количественно оценивать повреждение сосудов путем измерения ЦИК. ЦИК будут выделять путем экстракции иммуномагнитных шариков (на основе международного консенсусного протокола) и подсчитывать с использованием камеры Нажотта/флуоресцентной микроскопии. Подсчет CEC определяется как яркие клетки Ulex-europaeus-lectin размером > 10 мкм, к которым прикреплены 5 магнитных шариков19. Данные будут проанализированы в контексте данных ЭМИ (Цель 1), поскольку комбинация даст представление о степени повреждения эндотелия при ВЗК по сравнению с контролем.

Цель 3. Есть ли у детей с ВЗК признаки структурного заболевания артерий? Скорость пульсовой волны (СРПВ) будет индикатором структурного здоровья артерий. Кривые давления будут записываться одновременно в двух точках (сонно-бедренная) с использованием программного обеспечения для анализа VICORDER (Skidmore Medical Limited);

Цель 4. Какая связь между показателями воспаления и установленными медиаторами сосудистого повреждения? Уровни hs-CRP, сывороточного амилоида A (SAA), TNF-α, IL-1α, IL-1β, IL-6, MCP-1, VEGF, липидов натощак и ангиопоэтина 1/2 будут коррелировать с подтвержденной клинической оценкой активность заболевания [Индекс активности ЯК у детей20 (PUCAI) и Индекс активности БК у детей (PCDAI)] в дополнение к обычным маркерам (СРБ, СОЭ, D-димеры и тромбоциты при активном и неактивном заболевании). Во многих случаях обычные циркулирующие маркеры не коррелируют с эндоскопическими данными при активном заболевании; нетрадиционные маркеры могут демонстрировать более высокую чувствительность при выявлении пациентов с продолжающимся активным воспалением.

Методология:

1. Сбор клинических данных. Клинические данные субъектов будут сопоставлены с обезличенной электронной таблицей Excel из бумажной формы сбора данных, которая использовалась в пилотном исследовании. Собранные клинические данные будут включать возраст, пол, возраст на момент постановки диагноза ВЗК, состояние коронарной артерии на момент поступления и в настоящее время, рост и индекс массы тела, артериальное давление, семейный анамнез сердечно-сосудистых заболеваний и статус курения.
2. Хроническое воспаление будет оцениваться с помощью многокомпонентной электрохемилюминесцентной детекции плазмы Meso Scale Discovery (MSD, Мэриленд, США): hs-CRP, SAA, TNF-α, IL-6, 8 и 10, MCP-1, VEGF, ангиопоэтин 1. и 2 (последний опосредует отслойку эндотелия при системном васкулите (66). Этот метод позволяет анализировать многие параметры из очень небольшого количества крови и был использован (в соответствии с инструкциями производителя) с большим успехом в пилотном исследовании; д. Эндотелиальную активацию/повреждение будут оценивать с помощью: подсчета ЦИК, количественно определяемого путем выделения иммуномагнитных шариков (IB) из цельной крови с использованием шариков, покрытых анти-CD146, затем окрашиваемых FITC-конъюгированным Ulex и подсчитываемых с использованием флуоресцентной микроскопии и счетной камеры Nageotte, как описано ранее наша группа и другие (46;67); EMP, экспрессирующие CD105, E-селектин, ICAM-1, VCAM-1 CD144, CD31, но отрицательные по маркерам тромбоцитов CD42a или CD62P, будут количественно определяться в бедной тромбоцитами плазме с использованием проточного цитометра BD FACSArray, как описано ранее нашей группой (44). ); е. Потенциал восстановления эндотелия будет оцениваться в общей сложности у 45 субъектов (по 15 из каждой группы: KD CAA+, CAA- и здоровые контроли) путем оценки (i) емкости колониеобразующих единиц (КОЕ) EPC (68) и (ii) EPC. возможность включения в сосудистые структуры HUVEC в матригеле (69), и в настоящее время эта процедура регулярно выполняется нашей группой (см. ниже). EPC получают из PBMC, выделенных из 5 мл крови, помещают в чашки для культивирования, покрытые человеческим фибронектином, и выдерживают в EGM-2 с добавлением 20% фетальной телячьей сыворотки и 40 нг/мл VEGF. После 4 дней культивирования неприлипшие клетки удаляют промыванием фосфатно-солевым буфером, а прилипшие клетки поддерживают в культуре до 7 дня. Затем подсчитывают ранние колониеобразующие единицы ЭПК. Амплифицированные ЭПК, собранные, как описано выше, затем метят Di-I-LDL и повторно высевают с помощью HUVEC поверх слоя затвердевшего матригеля и инкубируют при 37°C в течение 24 часов. Флуоресцентную микроскопию используют для оценки включения EPC в капиллярную решетку HUVEC, и образование канальцев HUVEC (структура, длина которой в четыре раза больше ширины) будет сравниваться с использованием EPC от KD (+/- CAA) до здоровых контролей. Для каждой лунки оценивают пять независимых полей и определяют среднее число канальцев/×100 поля. ф. Жесткость сосудов и КИМ сонных артерий будут оцениваться по: (i) скорости каротидно-бедренной и каротидно-лучевой пульсовой волны (СРПВ) с использованием устройства Vicorder (Skidmore Medical Limited); Все эти методы регулярно выполняются нашей группой в соответствии с рекомендациями AHA (70), что подтверждается нашими экспериментальными данными и нашими ранее опубликованными исследованиями (71-73).