Vasculaire disfunctie bij pediatrische IBD

Onderzoeksplan:

Patiënten: 130 kinderen en adolescenten (8-21 jaar) met een verwachte verhouding van 60% (n=78) ziekte van Crohn (CD), 35% (n=45) colitis ulcerosa (UC) 5% (n=6) onbepaalde colitis (IC). Er zullen 78 op leeftijd en geslacht afgestemde controles worden onderzocht. Berekeningen van de steekproefomvang zijn gebaseerd op circulerende endotheelcellen (CEC's) als het primaire eindpunt, zoals gesuggereerd door een lopend onderzoek door een van de medeaanvragers, bij gezonde kinderen en kinderen met de ziekte van Kawasaki (Brogan P et al, ref gepubliceerd).

Er zijn 40 proefpersonen/groep nodig om een ​​verdubbeling van het gemiddelde van CEC's in CD en CU vs. controle te detecteren met 90% power, significantie 0,05 en dit zou haalbaar moeten zijn door onze eerste rekrutering. Niet-normaliteit en de noodzaak om niet-parametrisch of transformerend te gebruiken voorafgaand aan analyse, verhoogt het aantal tot 47; daarom zullen we ernaar streven om 50 te rekruteren voor de UC-groep. Dit zorgt voor voldoende vermogen en is haalbaar op basis van het klinische cohort dat ons ter beschikking staat.

Dit patiëntencohort is een geschikte kandidaatgroep voor het huidige onderzoek

1. Er zijn aanwijzingen dat vasculaire veranderingen die optreden tussen 10-20 jaar oud een cruciale bepalende factor zijn voor de toekomstige gezondheid van het vaatstelsel;
2. Initiatie in rookgewoonten is het meest waarschijnlijk in de tienerjaren en
3. Andere gevestigde traditionele risicofactoren voor atherosclerose (zoals hypertensie, type II diabetes of zelfs volledig vastgestelde atherosclerotische ziekte) die zouden fungeren als verstorende variabelen, zijn nog niet aanwezig in de adolescentie.

Gegevens zullen worden verzameld op een geanonimiseerd Excel-blad en omvatten leeftijd, geslacht, leeftijd bij diagnose, kransslagaderstatus bij presentatie, groei, body mass index, bloeddruk, familiegeschiedenis van HVZ en rookstatus.

Doel 1: Hebben kinderen met IBD tekenen van een MP-gemedieerde protrombotische tendens? MP's zullen worden geïdentificeerd door flowcytometrie zoals eerder beschreven door onze groep. In het kort, bloedplaatjes-arm plasma (PPP) zal uit bloed worden verkregen en bij -80 °C worden bewaard voor toekomstige batchtests. 200 μl PPP maakt sedimentatie van MP's mogelijk die opnieuw worden gesuspendeerd in Annexine V (AnV) bindingsbuffer voorafgaand aan kleuring met FITC- of phycoerythrin-AnV (BD PharMingen). Endotheel-, bloedplaatjes- en neutrofiel-afgeleide MP's (EMP's/PMP's/NMP's) en Tissue-Factor (TF) zullen worden geteld door detectie met anti-menselijke (CD62E, CD41 en CD11b activatie-epitoop die respectievelijk bindt aan geactiveerde neutrofielen, plus relevante isotypecontroles ). Latexparels (1,1 μm) worden gebruikt om MP's < 1,1 μm door te laten. Het trombotische potentieel van MP's zal worden gekwantificeerd door MP's te suspenderen in controle microdeeltjesvrij plasma (MPFP) dat trypsineremmer bevat [remt contactactivering], gevolgd door blootstelling aan calcium-fluorogeen substraat (Z-G-G-R-AMC). De kinetiek van de vorming van trombine wordt geregistreerd tot 90 minuten na stimulatie. Vertragingstijd min, piektrombine nM, snelheidsindex nM/min en endogene trombinepotentiaal (ETP) nM × min worden berekend. Om de relatieve bijdrage van PS en TF aan MP-gemedieerde trombinegeneratie te onderzoeken, zullen MP's worden voorgeïncubeerd met toenemende concentraties van recombinant AnV-eiwit of een blokkerende anti-TF (of isotypecontrole) voorafgaand aan trombineanalyse.

Doel 2. Hebben kinderen met IBD tekenen van endotheliaal letsel? Naast het onderzoeken van arteriële gezondheid (hieronder), zullen we vasculair letsel kwantificeren door CEC's te meten. CEC's zullen worden geïsoleerd door immunomagnetische parelextractie (gebaseerd op een internationaal consensusprotocol) en geteld met behulp van een Nageotte-kamer/fluorescentiemicroscopie. CEC-opsomming wordt gedefinieerd als heldere Ulex-europaeus-lectine-cellen van> 10 μm groot, waaraan 5 magnetische korrels zijn bevestigd . Gegevens zullen worden geanalyseerd in de context van EMP-gegevens (Doel 1), aangezien de combinatie inzicht zal geven in de mate van endotheliaal letsel bij IBD versus controle.

Doel 3. Hebben kinderen met IBD tekenen van structurele arteriële ziekte? Pulse Wave Velocity (PWV) zal een indicator zijn van de arteriële structurele gezondheid. Drukgolfvormen worden gelijktijdig geregistreerd op twee locaties (halsslagader-femoraal) met behulp van de VICORDER-analysesoftware (Skidmore Medical Limited);

Doel 4. Wat is de relatie tussen ontstekingsindices en gevestigde mediatoren van vasculair letsel? Niveaus van hs-CRP, serumamyloïde A (SAA), TNF-α, IL-1α, IL-1β, IL-6, MCP-1, VEGF, nuchtere lipiden en angiopoëtine 1/2 zullen worden gecorreleerd met gevalideerde klinische beoordeling van ziekteactiviteit [Paediatric UC Activity Index20 (PUCAI) & Pediatric CD Activity Index (PCDAI)] naast conventionele markers (CRP, ESR, D-dimeren en bloedplaatjes bij actieve en inactieve ziekte). In veel gevallen correleren conventionele circulerende markers niet met endoscopische bevindingen bij actieve ziekte; de niet-conventionele markers kunnen een hogere gevoeligheid vertonen bij het detecteren van mensen met een aanhoudende actieve ontsteking.

Methodologie:

1. Klinische gegevensverzameling: Klinische gegevens van de proefpersoon zullen worden verzameld op een geanonimiseerd Excel-spreadsheet van een proforma voor het verzamelen van papieren gegevens zoals gebruikt in de pilotstudie. De verzamelde klinische gegevens omvatten leeftijd, geslacht, leeftijd bij IBD-diagnose, kransslagaderstatus bij presentatie en momenteel, groei en body mass index, bloeddruk, familiegeschiedenis van hart- en vaatziekten en rookstatus.
2. Chronische ontsteking zal worden beoordeeld met behulp van Meso Scale Discovery (MSD, Maryland, VS) multi-array elektrochemiluminescentiedetectie van plasma: hs-CRP, SAA, TNF-α, IL-6, 8 en 10, MCP-1, VEGF, angiopoëtine 1 en 2 (de laatste bemiddelt endotheelloslating bij systemische vasculitis (66). Met deze techniek kunnen veel parameters worden getest uit zeer kleine hoeveelheden bloed en werd (volgens de instructies van de fabrikant) met groot succes gebruikt in de pilotstudie; D. Endotheliale activatie/beschadiging zal worden beoordeeld door: CEC-telling gekwantificeerd door immunomagnetische korrels (IB) isolatie uit volbloed met behulp van anti-CD146 gecoate korrels, vervolgens gekleurd met FITC-geconjugeerde Ulex en geteld met behulp van fluorescentiemicroscopie en een Nageotte-telkamer zoals eerder beschreven door onze groep en anderen (46;67); EMP's die CD105, E-selectin, ICAM-1, VCAM-1 CD144, CD31 tot expressie brengen, maar negatief voor de bloedplaatjesmarkers CD42a of CD62P zullen worden gekwantificeerd uit bloedplaatjesarm plasma met behulp van een BD FACSArray flowcytometer zoals eerder beschreven door onze groep (44 ); e. Het endotheelherstelpotentieel zal worden beoordeeld bij in totaal 45 proefpersonen (15 uit elke groep: KD CAA+, CAA- en gezonde controles) door beoordeling van (i) EPC-capaciteit van kolonievormende eenheid (CFU) (68), en (ii) EPC potentieel om op te nemen in HUVEC-vasculaire structuren in matrigel (69), en nu routinematig uitgevoerd door onze groep (zie hieronder). EPC's worden bereid uit PBMC's geïsoleerd uit 5 ml bloed, worden uitgeplaat in kweekschalen bekleed met humaan fibronectine en bewaard in EGM-2 aangevuld met 20% foetaal kalfsserum en 40 ng/ml VEGF. Na 4 dagen in kweek worden niet-hechtende cellen verwijderd door wassen met fosfaatgebufferde zoutoplossing en de hechtende cellen worden tot dag 7 in kweek gehouden. Vroege EPC-kolonievormende eenheden worden vervolgens geteld. Geamplificeerde EPC's die zijn geoogst zoals hierboven beschreven, worden vervolgens gemerkt met Di-I-LDL en opnieuw uitgeplaat met HUVEC bovenop een gestolde matrigellaag en gedurende 24 uur bij 37 °C geïncubeerd. Fluorescentiemicroscopie wordt gebruikt om de opname van EPC's in het HUVEC-capillaire rooster te beoordelen, en de vorming van HUVEC-tubuli (structuur met een lengte van vier keer de breedte) zal worden vergeleken met behulp van EPC van KD (+/- CAA) met gezonde controles. Voor elk putje worden vijf onafhankelijke velden beoordeeld en het gemiddelde aantal tubuli/x100 veld wordt bepaald. F. Vasculaire stijfheid en IMT van de halsslagader zullen worden beoordeeld door: (i) halsslagader-femorale en halsslagader-radiale pulsgolfsnelheid (PWV) met behulp van het Vicorder-apparaat (Skidmore Medical Limited); Al deze technieken worden routinematig door onze groep uitgevoerd in overeenstemming met de AHA-aanbevelingen (70), zoals geïllustreerd door onze proefgegevens en onze eerder gepubliceerde studies (71-73).