소아 IBD의 혈관 기능 장애

조사 계획:

환자: 소아청소년(8-21세) 130명 예상 비율 60%(n=78) 크론병(CD), 35%(n=45) 궤양성 대장염(UC) 5%(n=6) 불확정 대장염 (IC). 78명의 연령 및 성별 대조 대조군이 조사될 것입니다. 샘플 크기 계산은 공동 지원자 중 한 명이 진행 중인 연구에서 건강한 어린이와 가와사키병을 앓는 어린이에 대해 제안한 대로 순환 내피 세포(CEC)를 1차 종료점으로 기반으로 합니다(Brogan P et al, ref 게시됨).

40명의 피험자/그룹은 90% 검정력, 유의도 0.05로 CD 및 UC 대 대조군에서 CEC의 배가 평균을 감지해야 하며 이는 초기 모집으로 달성할 수 있어야 합니다. 비정규성 및 분석 전에 비모수 또는 변환을 사용해야 하는 필요성으로 인해 숫자가 47로 증가합니다. 따라서 우리는 UC 그룹에 50명을 모집하는 것을 목표로 할 것입니다. 이것은 적절한 힘을 제공할 것이며 우리가 사용할 수 있는 임상 코호트를 기반으로 실현 가능합니다.

이 환자 코호트는 다음과 같은 현재 조사에 적합한 후보 그룹입니다.

1. 증거에 따르면 10-20세 사이에 발생하는 혈관 변화는 미래의 혈관 구조 건강을 결정하는 중요한 요소입니다.
2. 흡연 습관이 시작되는 시기는 대부분 십대 때이며,
3. 혼란 변수로 작용할 죽상동맥경화증에 대한 다른 확립된 전통적인 위험 요소(예: 고혈압, 제2형 당뇨병 또는 완전히 확립된 죽상경화성 질환)는 아직 청소년기에 나타나지 않습니다.

데이터는 식별되지 않은 엑셀 시트에 수집되며 연령, 성별, 진단 연령, 프레젠테이션 시 관상 동맥 상태, 성장, 체질량 지수, 혈압, CVD 가족력 및 흡연 상태가 포함됩니다.

목표 1: IBD를 가진 어린이는 MP 매개 친혈전 경향의 증거가 있습니까? MP는 이전에 우리 그룹19에서 설명한 대로 유동 세포 계측법으로 식별됩니다. 간단히 말해서, 혈소판 부족 혈장(PPP)은 혈액에서 얻어 향후 배치 테스트를 위해 -80°C에 보관됩니다. 200 μL의 PPP는 FITC- 또는 피코에리트린-AnV(BD PharMingen)로 염색하기 전에 Annexin V(AnV) 결합 완충액에 재현탁될 MP의 침전을 허용합니다. 내피, 혈소판 및 호중구 유래 MP(EMPs/PMPs/NMPs) 및 조직 인자(TF)는 각각 활성화된 호중구에 결합하는 항인간(CD62E, CD41 및 CD11b 활성화 에피토프 및 관련 이소타입 컨트롤을 사용한 검출에 의해 열거됩니다. ). 라텍스 비드(1.1μm)는 1.1μm 미만의 MP를 게이트하는 데 사용됩니다. MP의 혈전 가능성은 트립신 억제제[접촉 활성화를 억제]를 포함하는 대조군 미립자 없는 혈장(MPFP)에서 MP를 중단하고 칼슘-형광 기질(Z-G-G-R-AMC)에 노출함으로써 정량화됩니다. 트롬빈 생성의 동역학은 자극 후 최대 90분까지 기록됩니다. 지연 시간 분, 피크 트롬빈 nM, 속도 지수 nM/분 및 내인성 트롬빈 전위(ETP) nM × 분을 계산합니다. MP-매개 트롬빈 생성에 대한 PS 및 TF의 상대적인 기여도를 조사하기 위해 트롬빈 분석 전에 MP를 증가하는 농도의 재조합 AnV 단백질 또는 차단 항-TF(또는 이소타입 대조군)와 함께 사전 배양할 것이다.

목표 2. IBD를 가진 어린이는 내피 손상의 증거가 있습니까? 동맥 건강(아래)을 조사하는 것 외에도 CEC를 측정하여 혈관 손상을 정량화합니다. CEC는 면역자기 비드 추출(국제 합의 프로토콜 기반)에 의해 분리되고 Nageotte 챔버/형광 현미경을 사용하여 계산됩니다. CEC 열거는 5개의 자기 비드가 부착된 크기 >10 μm의 Ulex-유로페우스-렉틴 밝은 세포로 정의됩니다19. 데이터는 EMP 데이터(목표 1)의 맥락에서 분석될 것입니다. 조합이 IBD 대 대조군의 내피 손상 정도에 대한 통찰력을 제공할 것이기 때문입니다.

목표 3. IBD가 있는 어린이는 구조적 동맥 질환의 증거가 있습니까? PWV(Pulse Wave Velocity)는 동맥 구조의 건강 상태를 나타내는 지표가 될 것입니다. 압력 파형은 VICORDER 분석 소프트웨어(Skidmore Medical Limited)를 사용하여 두 부위(경동맥-대퇴골)에서 동시에 기록됩니다.

목표 4. 염증 지표와 혈관 손상의 확립된 매개체 사이의 관계는 무엇입니까? hs-CRP, 혈청 아밀로이드 A(SAA), TNF-α, IL-1α, IL-1β, IL-6, MCP-1, VEGF, 공복 지질 및 안지오포이에틴 1/2의 수준은 기존 마커(활성 및 비활성 질환의 CRP, ESR, D-Dimer 및 혈소판) 외에 질병 활동[소아 UC 활동 지수20(PUCAI) 및 소아 CD 활동 지수(PCDAI)]. 많은 경우에 기존의 순환 마커는 활동성 질환의 내시경 소견과 상관관계가 없습니다. 비전통적인 마커는 진행 중인 활성 염증을 감지하는 데 더 높은 민감도를 보일 수 있습니다.

방법론:

1. 임상 데이터 수집: 피험자 임상 데이터는 파일럿 연구에 사용된 종이 데이터 수집 형식에서 비식별화된 엑셀 스프레드 시트에 수집됩니다. 수집된 임상 데이터에는 연령, 성별, IBD 진단 시 연령, 발표 시 관상 동맥 상태 및 현재, 성장 및 체질량 지수, 혈압, 심혈관 질환의 가족력 및 흡연 상태가 포함됩니다.
2. 만성 염증은 혈장의 Meso Scale Discovery(MSD, Maryland, USA) 다중 배열 전기화학발광 검출을 사용하여 평가합니다: hs-CRP, SAA, TNF-α, IL-6, 8 및 10, MCP-1, VEGF, 안지오포이에틴 1 및 2(후자는 전신 혈관염에서 내피 박리를 중재함(66). 이 기술을 사용하면 매우 적은 양의 혈액에서 많은 매개변수를 분석할 수 있으며 파일럿 연구에서 큰 성공을 거두며 (제조업체 지침에 따라) 사용되었습니다. 디. 내피 활성화/손상은 다음에 의해 평가될 것입니다: 항-CD146 코팅된 비드를 사용하여 전혈로부터 면역자기 비드(IB) 분리에 의해 정량화된 CEC 수, 그 후 FITC-접합된 Ulex로 염색하고 이전에 기술된 바와 같이 형광 현미경 및 Nageotte 계수 챔버를 사용하여 열거됨 우리 그룹과 다른 사람들(46;67); CD105, E-selectin, ICAM-1, VCAM-1 CD144, CD31을 발현하지만 혈소판 마커 CD42a 또는 CD62P에 대해 음성인 EMP는 이전에 우리 그룹(44 ); 이자형. (i) EPC 콜로니 형성 단위(CFU) 용량(68) 및 (ii) EPC matrigel(69)에서 HUVEC 혈관 구조에 통합할 가능성이 있으며 현재 우리 그룹에서 일상적으로 수행하고 있습니다(아래 참조). EPC는 5ml의 혈액으로부터 분리된 PBMC로부터 제조되며 인간 피브로넥틴으로 코팅된 배양 접시에 플레이팅되고 20% 소 태아 혈청 및 40ng/ml VEGF가 보충된 EGM-2에서 유지됩니다. 배양 4일 후, 비부착 세포는 인산염 완충 식염수로 세척하여 제거하고 부착 세포는 7일까지 배양을 유지합니다. 그런 다음 초기 EPC 콜로니 형성 단위를 계산합니다. 위에서 설명한 대로 수확된 증폭된 EPC는 Di-I-LDL로 표지되고 응고된 매트리겔 층 위에 HUVEC로 다시 도금되고 37°C에서 24시간 동안 배양됩니다. HUVEC 모세관 격자로의 EPC 통합을 평가하기 위해 형광 현미경을 사용하고, KD(+/- CAA)에서 건강한 대조군까지의 EPC를 사용하여 HUVEC 세관 형성(폭의 4배 길이를 나타내는 구조)을 비교합니다. 5개의 독립적인 필드가 각 웰에 대해 평가되고 평균 세관 수/x100 필드가 결정됩니다. 에프. 혈관 경직 및 경동맥 IMT는 (i) Vicorder 장치(Skidmore Medical Limited)를 사용하여 경동맥-대퇴 및 경동맥-요골 맥파 속도(PWV); 이러한 모든 기술은 파일럿 데이터와 이전에 발표된 연구(71-73)에서 설명한 바와 같이 AHA 권장 사항(70)에 따라 우리 그룹에서 일상적으로 수행됩니다.