Dysfunkcja naczyniowa w pediatrycznym nieswoistym zapaleniu jelit

Plan śledztwa:

Pacjenci: 130 dzieci i młodzieży (8-21 lat) z przewidywanym odsetkiem 60% (n=78) Choroba Leśniowskiego-Crohna (CD), 35% (n=45) Wrzodziejące zapalenie jelita grubego (UC) 5% (n=6) Nieokreślone zapalenie jelita grubego (IC). Zbadanych zostanie 78 grup kontrolnych dobranych pod względem wieku i płci. Obliczenia wielkości próby opierają się na krążących komórkach śródbłonka (CEC) jako głównym punkcie końcowym, jak sugeruje trwające badanie przeprowadzone przez jednego ze współwnioskodawców, na zdrowych dzieciach i dzieciach z chorobą Kawasaki (Brogan P i in., ref. opublikowany).

Wymaganych jest 40 osób/grupę do wykrycia podwojonej średniej CEC w CD i UC w porównaniu z kontrolą z mocą 90%, istotnością 0,05 i powinno to być możliwe do osiągnięcia przez naszą wstępną rekrutację. Nienormalność i konieczność użycia nieparametrycznej lub transformacji przed analizą zwiększa liczbę do 47; dlatego będziemy dążyć do rekrutacji 50 osób do grupy UC. Zapewni to odpowiednią moc i jest wykonalne w oparciu o dostępną nam kohortę kliniczną.

Ta kohorta pacjentów jest odpowiednią grupą kandydatów do niniejszego badania jako

1. Dowody wskazują, że zmiany naczyniowe, które pojawiają się między 10 a 20 rokiem życia, są krytycznym wyznacznikiem przyszłego zdrowia układu naczyniowego;
2. Inicjacja w nawyk palenia jest najbardziej prawdopodobna w wieku nastoletnim i
3. Inne ustalone tradycyjne czynniki ryzyka miażdżycy (takie jak nadciśnienie, cukrzyca typu II, a nawet w pełni ugruntowana choroba miażdżycowa), które mogłyby działać jako zmienne zakłócające, nie są jeszcze obecne w okresie dojrzewania.

Dane zostaną zebrane na arkuszu programu Excel pozbawionym elementów umożliwiających identyfikację i będą obejmować wiek, płeć, wiek w momencie rozpoznania, stan tętnicy wieńcowej w momencie prezentacji, wzrost, wskaźnik masy ciała, ciśnienie krwi, historię chorób układu krążenia w rodzinie i palenie tytoniu.

Cel 1: Czy dzieci z nieswoistym zapaleniem jelit mają dowody na skłonność do prozakrzepu, w której pośredniczy MP? MP zostaną zidentyfikowane za pomocą cytometrii przepływowej, jak opisano wcześniej przez naszą grupę19. Pokrótce, osocze ubogie w płytki krwi (PPP) zostanie uzyskane z krwi i przechowywane w temperaturze -80°C do przyszłych testów partii. 200 μl PPP umożliwi sedymentację MP, które zostaną ponownie zawieszone w buforze wiążącym aneksynę V (AnV) przed barwieniem FITC- lub fikoerytryną-AnV (BD PharMingen). Śródbłonkowe, płytkowe i pochodzące z neutrofili MP (EMP/PMP/NMP) oraz czynnik tkankowy (TF) zostaną zliczone przez wykrycie anty-ludzkim epitopem aktywacyjnym (CD62E, CD41 i CD11b, który wiąże się odpowiednio z aktywowanymi neutrofilami, plus odpowiednie kontrole izotypowe) ). Kulki lateksowe (1,1 μm) są używane do bramkowania MP <1,1 μm. Potencjał zakrzepowy MP zostanie określony ilościowo przez zawieszenie MP w kontrolnym osoczu wolnym od mikrocząstek (MPFP) zawierającym inhibitor trypsyny [hamuje aktywację kontaktową], a następnie ekspozycję na fluorogeniczny substrat wapniowy (Z-G-G-R-AMC). Kinetyka wytwarzania trombiny będzie rejestrowana do 90 minut po stymulacji. Obliczony zostanie czas opóźnienia min, pik trombiny nM, wskaźnik prędkości nM/min i endogenny potencjał trombiny (ETP) nM × min. Aby zbadać względny udział PS i TF w wytwarzaniu trombiny za pośrednictwem MP, MP będą wstępnie inkubowane ze wzrastającymi stężeniami rekombinowanego białka AnV lub blokującego anty-TF (lub kontroli izotypowej) przed analizą trombiny.

Cel 2. Czy dzieci z nieswoistym zapaleniem jelit mają objawy uszkodzenia śródbłonka? Oprócz badania stanu tętnic (poniżej) będziemy oceniać ilościowo uszkodzenie naczyń poprzez pomiar CEC. CEC zostaną wyizolowane przez ekstrakcję immunomagnetycznych kulek (w oparciu o międzynarodowy protokół konsensusu) i zliczone przy użyciu komory Nageotte/mikroskopii fluorescencyjnej. Liczenie CEC definiuje się jako jasne komórki Ulex-europaeus-lektyna o wielkości >10 μm, z dołączonymi 5 kulkami magnetycznymi19. Dane zostaną przeanalizowane w kontekście danych EMP (Cel 1), ponieważ połączenie da wgląd w stopień uszkodzenia śródbłonka w IBD w porównaniu z grupą kontrolną.

Cel 3. Czy dzieci z IBD mają cechy strukturalnej choroby tętnic? Prędkość fali tętna (PWV) będzie wskaźnikiem stanu strukturalnego tętnic. Przebiegi ciśnienia będą rejestrowane jednocześnie w dwóch miejscach (szyjna-udowa) przy użyciu oprogramowania do analizy VICORDER (Skidmore Medical Limited);

Cel 4. Jaki jest związek między wskaźnikami stanu zapalnego a ustalonymi mediatorami uszkodzenia naczyń? Stężenia hs-CRP, amyloidu A w surowicy (SAA), TNF-α, IL-1α, IL-1β, IL-6, MCP-1, VEGF, lipidów na czczo i angiopoetyny 1/2 będą skorelowane z potwierdzoną oceną kliniczną aktywność choroby [Paediatric UC Activity Index20 (PUCAI) & Pediatric CD Activity Index (PCDAI)] oprócz konwencjonalnych markerów (CRP, OB, D-dimery i płytki krwi w aktywnej i nieaktywnej chorobie). W wielu przypadkach konwencjonalne krążące markery nie korelują z wynikami badań endoskopowych w aktywnej chorobie; niekonwencjonalne markery mogą wykazywać wyższą czułość w wykrywaniu osób z trwającym aktywnym stanem zapalnym.

Metodologia:

1. Gromadzenie danych klinicznych: dane kliniczne pacjenta zostaną zebrane w arkuszu kalkulacyjnym programu Excel pozbawionym elementów umożliwiających identyfikację z papierowego formularza zbierania danych, tak jak zastosowano w badaniu pilotażowym. Zebrane dane kliniczne będą obejmować wiek, płeć, wiek w momencie rozpoznania IBD, stan tętnicy wieńcowej w momencie prezentacji i obecnie, wzrost i wskaźnik masy ciała, ciśnienie krwi, wywiad rodzinny w kierunku chorób układu krążenia i palenie tytoniu.
2. Przewlekły stan zapalny będzie oceniany za pomocą wielomacierzowej elektrochemiluminescencyjnej detekcji osocza Meso Scale Discovery (MSD, Maryland, USA): hs-CRP, SAA, TNF-α, IL-6, 8 i 10, MCP-1, VEGF, angiopoetyna 1 i 2 (ten ostatni pośredniczy w odwarstwieniu śródbłonka w układowym zapaleniu naczyń (66). Technika ta pozwala na oznaczenie wielu parametrów z bardzo małych ilości krwi i została zastosowana (zgodnie z zaleceniami producenta) z dużym powodzeniem w badaniu pilotażowym; D. Aktywacja/uszkodzenie śródbłonka zostanie ocenione przez: liczbę CEC oznaczoną ilościowo przez izolację kulek immunomagnetycznych (IB) z krwi pełnej przy użyciu kulek pokrytych anty-CD146, następnie wybarwioną Ulex skoniugowanym z FITC i policzoną przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej i komory do zliczania Nageotte, jak opisano wcześniej przez nasza grupa i inni (46;67); EMP wyrażające CD105, E-selektynę, ICAM-1, VCAM-1 CD144, CD31, ale ujemne dla markerów płytkowych CD42a lub CD62P będą oznaczane ilościowo z osocza ubogopłytkowego przy użyciu cytometru przepływowego BD FACSArray, jak opisano wcześniej przez naszą grupę (44 ); mi. Potencjał naprawy śródbłonka zostanie oceniony łącznie u 45 osób (15 z każdej grupy: KD CAA+, CAA- i zdrowe kontrole) poprzez ocenę (i) zdolności jednostki tworzącej kolonie (CFU) EPC (68) oraz (ii) EPC potencjał do włączenia do struktur naczyniowych HUVEC w matrigel (69), a obecnie rutynowo wykonywane przez naszą grupę (patrz poniżej). EPC przygotowuje się z PBMC wyizolowanych z 5 ml krwi i umieszcza na szalkach do hodowli pokrytych ludzką fibronektyną i utrzymuje w EGM-2 uzupełnionym 20% płodową surowicą cielęcą i 40 ng/ml VEGF. Po 4 dniach w hodowli, komórki nieadhezyjne usuwa się przez przemywanie solą fizjologiczną buforowaną fosforanami, a komórki adherentne utrzymuje się w hodowli do 7 dnia. Następnie zlicza się jednostki tworzące wczesne kolonie EPC. Amplifikowane EPC zebrane jak opisano powyżej są następnie znakowane Di-I-LDL i ponownie wysiewane z HUVEC na wierzch zestalonej warstwy matrigel i inkubowane w 37°C przez 24 godziny. Mikroskopię fluorescencyjną stosuje się do oceny włączania EPC do sieci kapilarnej HUVEC, a tworzenie kanalików HUVEC (struktura wykazująca długość czterokrotność jej szerokości) zostanie porównane przy użyciu EPC z KD (+/- CAA) do zdrowych kontroli. Dla każdej studzienki ocenia się pięć niezależnych pól i określa się średnią liczbę kanalików/x100 pól. F. Sztywność naczyń i IMT tętnicy szyjnej zostaną ocenione na podstawie: (i) prędkości fali tętna w tętnicy szyjnej-udowej i szyjno-promieniowej (PWV) przy użyciu urządzenia Vicorder (Skidmore Medical Limited); Wszystkie te techniki są rutynowo wykonywane przez naszą grupę zgodnie z zaleceniami AHA (70), co ilustrują nasze dane pilotażowe i nasze wcześniej opublikowane badania (71-73).