PPI 疗法对体重、肠道菌群以及 GPR41 和 GPR43 表达的影响

研究计划：

计划在 UCH 内窥镜检查实验室进行筛查或监测结肠镜检查（针对结直肠癌）的无胃肠道症状的患者将根据纳入和排除标准进行研究筛查。 同意研究的合格患者将测量和记录身高、体重和人口统计信息。 他们将完成一份体重/饮食史问卷。 患者将根据常规临床护理接受筛查/监测结肠镜检查。 残余粪便通过结肠镜标准吸出，以确保粘膜完全可视化，以增强息肉检测。 我们将从三个不同的位置抽吸粪便：乙状结肠、盲肠和末端回肠。 有证据表明，肠道准备（在结肠镜检查之前）不会显着改变大多数受试者的肠道微生物群的组成。 我们还将在这三个部位中的每一个部位进行四次小型捏活组织检查。 粪便抽吸物和活检标本将在液态 N2 中快速冷冻，并冷冻在 -80C 下，直到需要进行化验为止。

我们将招募总共 48 名受试者，平均分为四组：OB/PPI、OB/非 PPI、NW/PPI 和 NW/非 PPI。 每周约有 40-50 名符合上述纳入/排除标准的患者在 UCH 接受筛查/监测结肠镜检查，使得在 6-9 个月内每周招募 2-3 名患者以实现目标入组是现实的。

目的 1：检查 PPI 使用对正常体重 (NW) 和肥胖 (OB) 患者结肠和回肠末端肠道微生物群的影响。 肠道微生物组将通过 16S rRNA 测序进行分析，以确定肠道生物多样性中与 PPI 相关的改变。

单独的无菌标本收集容器将用于粪便抽吸物和乙状结肠、盲肠和末端回肠的粘膜活检。 将使用用于微生物组分析的高通量 DNA 测序。

微生物组 16S rRNA 分析 总群落基因组 DNA 将从肠道标本和 16S rRNA 基因 PCR 扩增制备，如前所述。 将执行双端、多重测序。 单次运行将生成 10-20 百万个 DNA 序列，每个样本生成 100,000 个 rRNA 读数，以确保 >99% 的序列覆盖率。 多路分解、质量过滤、嵌合体去除和序列分类（使用 SINA/Silva）将遵循以前的出版物。 类似的序列被分组为基于分类学的操作分类单元（OTU）。

微生物组数据分析 主要结果是微生物组的相对丰度百分比 (PRA)，我们假设这在 PPI 使用者和非抑酸药物使用者之间会有所不同。 实验组之间不同的特定微生物群（种/属/门）将使用非参数两部分统计确定。 40 统计分析将在 = 0.05 时进行评估，并根据错误发现率 (FDR) 校正 p 值。 41 结果将通过物种特异性 QPCR 进行验证。

目标 2：确定 PPI 的使用是否会改变 NW 和 OB 个体中专用于发酵周期的肠道细菌 RNA 的相对量。 我们将对从肠道微生物组制备的大量 RNA 进行鸟枪法测序，以确定在使用 PPI 的患者中差异表达的微生物代谢途径。 从末端回肠、盲肠和乙状结肠抽吸粪便，如上详述。

RNA 分离和测序微生物 RNA 将使用 RiboPure 细菌提取试剂盒（Life Technologies Inc.，美国）从 50 mg 粪便抽吸物中提取。 对于这个试点项目，我们将对总共 48 名受试者的样本进行化验，这些受试者平均分为四组：OB/PPI、OB/非 PPI、NW/PPI 和 NW/非 PPI。 使用 Ribo-Zero 细菌和 Ribo-Zero 小鼠试剂盒（Epicentre, Inc, USA）去除宿主和微生物 rRNA。 将使用 ScriptSeq v2 RNA-Seq（细菌）试剂盒（Epicentre, Inc, USA）准备 RNA 样品用于测序。 测序将在 Illumina HiSeq2000 平台（UC-Denver Microarray and Genomics Core）上进行，该平台提供高覆盖深度。 为了保证可重复性的质量，每个标本的两个 mRNA 样本将被合并和测序。 在这个试点实验中，我们将为每个微生物元转录组数据集的每个样本生成约 20x106 个单端 150 碱基读数。

元转录组数据分析 将使用 BLASTX 搜索 GenBank 以及 NCBI 非冗余蛋白质数据库中目前可用的大约 1800 个细菌基因组序列，使用 <10- 的 E 值截止值在肽水平上执行细菌转录本的注释和计数5.44 样本之间广泛的功能差异将使用通过 COG、47 KEGG48 和 RAST/SEED 工具生成的注释进行评估。 49， 50 肠道微生物转录组的统计分析将侧重于鉴定组间差异表达的代谢途径。 44 具有高质量注释（E<10-5）的基因将被受试者（N）用于构建基因（M）的 NxM 矩阵，记录为给定基因和受试者注释的序列读数的数量。 将构建受试者 (N) 的类似 NxM 基因类别 (M) 矩阵，以列出分配给功能类别的序列读数的分布。 治疗组之间流行率或丰度不同的基因或基因类别将分别通过应用于矩阵中每个基因/类别的 Fisher 精确检验或 Kruskal-Wallis 检验来识别。 在校正 FDR 后，显着性将评估为 = 0.05。41 P 值将用于确定候选基因列表的优先级，以便使用 QPCR 筛选整个患者队列中的基因表达进行后续验证。

目标 3：确定 PPI 的使用在多大程度上改变了 NW 和 OB 患者结肠和末端回肠中 GPR41、GPR43 及其效应基因的表达。 活检标本将接受一组 RT-QPCR 检测，以监测受微生物 SCFA 产生影响的目标基因的表达。 如上所述，将获得来自末端回肠、盲肠和乙状结肠的活组织检查。

定量逆转录酶-PCR (qRT-PCR) 分析将使用 RNeasy Mini Kit (Qiagen) 和 ISOGEN (WAKO) 提取总 RNA。 使用 RNA 作为模板，使用莫洛尼鼠白血病病毒逆转录酶 (Invitrogen) 转录互补 DNA。 使用合适的引物，用 Taq DNA 聚合酶 (TaKaRa) 通过 PCR 扩增 cDNA。 将使用 DNA Engine Opticon-2 (MJ Research) 进行 qRT-PCR 分析。 表达将一式两份量化。

样本量和功效分析：

我们将招募 24 名 NW 和 24 名肥胖 (OB) 参与者。 NW 和 OB 组中有一半是 PPI 使用者，一半是非抑酸药物使用者。 目标 1 的主要结果是厚壁菌门和拟杆菌门的 PRA 差异。 将使用双向方差分析（BMI 类别和 PPI 使用的因素）。 根据我们的初步数据，我们将有 94% 的能力检测厚壁菌门 PRA 的差异（72% 对 52%，SD 为 20%），95% 的能力检测拟杆菌 PRA 的差异（16% 对 5 PPI 用户和非用户之间的 %，SD 为 5%。 目标 2 的主要结果是专用于发酵循环的细菌 RNA 的差异，而目标 3 的结果是 GPR 41 和 GPR 43 表达的差异。 基于肠道微生物群概况和随后的 SCFA 产生的预期差异，我们预计 PPI 使用者和非使用者之间的两种结果有 25% 的差异，为目标 2 和 3）提供 99% 的把握度）。 我们还将在 NW 和 OB 组内进行亚组分析。