Effekten av PPI-terapi på vikt, tarmmikrobiom och uttryck av GPR41 och GPR43

Forskningsplan:

Patienter utan gastrointestinala symtom som är schemalagda för en screening eller övervakning av koloskopi (för kolorektal cancer) vid UCH endoskopilabbet kommer att screenas för studien baserat på inklusions- och exkluderingskriterierna. Berättigade patienter som samtycker till studien kommer att få längd, vikt och demografisk information mätt och registrerad. De kommer att fylla i ett frågeformulär för vikt/diethistorik. Patienterna kommer att genomgå screening/övervakningskoloskopi per rutinmässig klinisk vård. Resterande avföring aspireras som standard genom koloskopet för att säkerställa fullständig visualisering av slemhinnan för att förbättra polypdetekteringen. Vi kommer att ta avföringsaspirater från tre separata platser: sigmoid colon, blindtarm och terminal ileum. Bevis tyder på att en tarmförberedelse (före koloskopi) inte signifikant förändrar sammansättningen av tarmmikrobiotan för majoriteten av försökspersonerna. Vi kommer också att ta fyra små, nypa biopsier på var och en av dessa tre platser. Avföringsaspirat och biopsiprover kommer att snabbfrysas i flytande N2 och frysas vid -80C tills de behövs för deras analyser.

Vi kommer att registrera totalt 48 försökspersoner fördelade lika mellan fyra grupper: OB/PPI, OB/icke-PPI, NW/PPI och NW/icke-PPI. Cirka 40-50 patienter per vecka som uppfyller ovanstående inklusions-/exklusionskriterier genomgår en screening/övervakningskoloskopi vid UCH, vilket gör rekrytering av 2-3 patienter/vecka under 6-9 månader realistisk för att nå målinriktad rekrytering.

Syfte 1: Att undersöka effekterna av PPI-användning på tarmmikrobiotan i kolon och terminal ileum hos normalviktiga (NW) och fetma (OB) patienter. Intestinala mikrobiomer kommer att profileras genom 16S rRNA-sekvensering för att identifiera PPI-associerade förändringar i tarmbiodiversiteten.

Separata sterila provtagningsbehållare kommer att användas för avföringsaspiraten och slemhinnebiopsier från sigmoid colon, blindtarm och terminal ileum. High-throughput DNA-sekvensering för mikrobiomanalys kommer att användas.

Mikrobiom 16S rRNA-profilering Totalt genomiskt DNA från samhället kommer att beredas från tarmprover och 16S rRNA-gener PCR amplifierade som tidigare beskrivits. Parad, multiplexad sekvensering kommer att utföras. 10-20 miljoner DNA-sekvenser kommer att genereras i en enda körning och 100 000 rRNA-avläsningar genereras per prov för att säkerställa >99 % sekvenstäckning. Demultiplexering, kvalitetsfiltrering, chimärborttagning och sekvensklassificering (med SINA/Silva) kommer att följa tidigare publikationer. Liknande sekvenser grupperas i operationella taxonomiska enheter (OTU) baserat på taxonomi.

Mikrobiomdataanalys Huvudresultatet är den procentuella relativa förekomsten (PRA) av mikrobiella grupper, och vi antar att detta kommer att skilja sig mellan PPI-användare och icke-användare av syradämpande mediciner. Specifika mikrobiella grupper (arter/släkten/fyla) som skiljer sig mellan experimentella grupper kommer att identifieras med hjälp av en icke-parametrisk tvådelad statistik.40 Statistiska analyser kommer att bedömas till = 0,05 och p-värden korrigeras för falsk upptäcktsfrekvens (FDR).41 Resultaten kommer att valideras med artspecifik QPCR.

Syfte 2: Att avgöra om PPI-användning förändrar den relativa mängden tarmbakterie-RNA som är dedikerad till fermenteringscykeln hos NW- och OB-individer. Vi kommer att utföra hagelgevärssekvensering av bulk-RNA framställt från tarmmikrobiomer för att identifiera mikrobiella metaboliska vägar differentiellt uttryckta hos patienter på PPI. Avföringsaspirat från terminal ileum, blindtarm och sigmoid colon kommer att erhållas enligt ovan.

RNA-isolering och sekvensering Mikrobiellt RNA kommer att extraheras från 50 mg fekala aspirater med hjälp av RiboPure Bacteria-extraktionssatsen (Life Technologies Inc., USA). För denna pilot kommer vi att analysera prover från totalt 48 försökspersoner fördelade lika mellan fyra grupper: OB/PPI, OB/icke-PPI, NW/PPI och NW/icke-PPI. Värd och mikrobiellt rRNA kommer att tas bort med hjälp av Ribo-Zero-bakterier och Ribo-Zero-muskit (Epicentre, Inc, USA). RNA-prover kommer att förberedas för sekvensering med hjälp av ScriptSeq v2 RNA-Seq (bakterier) kit (Epicentre, Inc, USA). Sekvensering kommer att utföras på en Illumina HiSeq2000-plattform (UC-Denver Microarray och Genomics Core), som ger ett högt täckningsdjup. För kvalitetssäkring av reproducerbarhet kommer två mRNA-prover av varje prov att slås samman och sekvenseras. I detta pilotexperiment kommer vi att generera ~20x106 enkeländs 150-baser avläsningar per prov för varje mikrobiell meta-transkriptomdatauppsättning.

Metatranskriptomdataanalys Annotering och uppräkning av bakteriella transkript kommer att utföras på peptidnivå med hjälp av BLASTX-sökningar mot de cirka 1800 bakteriegenomsekvenser som för närvarande finns tillgängliga i GenBank såväl som NCBI:s icke-redundanta proteindatabas med ett E-värde cutoff på <10- 5,44 Funktionella skillnader på bred nivå mellan prover kommer att bedömas med hjälp av annoteringar som genereras med COG,47 KEGG48 och RAST/SEED-verktygen.49, 50 Statistisk analys av enteriska mikrobiella transkriptom kommer att fokusera på identifiering av metabola vägar som uttrycks differentiellt mellan grupper.44 Gener med högkvalitativa annoteringar (E<10-5) kommer att användas för att konstruera en NxM-matris av gener (M) av försökspersoner (N) som registrerar antalet sekvensläsningar annoterade för en given gen och individ. En liknande NxM-matris av genkategorier (M) av försökspersoner (N) kommer att konstrueras för att tabulera fördelningen av sekvensläsningar tilldelade funktionella kategorier. Gener eller genkategorier som skiljer sig i prevalens eller förekomst mellan behandlingsgrupper kommer att identifieras av Fisher exakta test respektive Kruskal-Wallis test, applicerat på varje gen/kategori i matrisen. Signifikans kommer att bedömas till = 0,05, efter korrigering för FDR.41 kommer P-värden att användas för att prioritera en kandidatgenlista för uppföljningsvalidering med QPCR för att screena för genuttryck över hela patientkohorten.

Syfte 3: Att bestämma i vilken utsträckning PPI-användning förändrar uttrycket av GPR41, GPR43 och deras effektorgener i kolon och terminal ileum hos NW- och OB-patienter. Biopsiprover kommer att utsättas för en panel av RT-QPCR-analyser för att övervaka uttryck av målgener påverkade av mikrobiell SCFA-produktion. Biopsier från terminal ileum, blindtarm och sigmoid colon kommer att erhållas enligt ovan.

Kvantitativ analys av omvänt transkriptas-PCR (qRT-PCR) Totalt RNA kommer att extraheras med hjälp av RNeasy Mini Kit (Qiagen) och ISOGEN (WAKO). Komplementära DNA kommer att transkriberas med användning av RNA som mallar med Moloney murint leukemivirus omvänt transkriptas (Invitrogen). cDNA kommer att amplifieras genom PCR med Taq DNA-polymeras (TaKaRa) med användning av lämpliga primrar. qRT-PCR-analyser kommer att utföras med hjälp av DNA Engine Opticon-2 (MJ Research). Uttrycket kommer att kvantifieras i duplikat.

Provstorlek och effektanalys:

Vi kommer att registrera 24 NW och 24 obese (OB) deltagare. Hälften av NW- och OB-grupperna kommer att vara PPI-användare och hälften kommer att vara icke-användare av syradämpande mediciner. Det primära resultatet för mål 1 är skillnaden i PRA för Firmicutes och Bacteroidetes. En tvåvägs ANOVA (faktorer för BMI-kategori och PPI-användning) kommer att användas. Baserat på våra preliminära data kommer vi att ha 94 % förmåga att upptäcka en skillnad i PRA hos Firmicutes (72 % vs 52 % med SD på 20 %) och 95 % förmåga att upptäcka skillnader i PRA för Bacteroidetes (16 % vs 5 % med SD på 5 %) mellan PPI-användare och icke-användare. Det primära resultatet för mål 2 är skillnaden i bakteriellt RNA dedikerat till fermenteringscykeln medan resultatet för mål 3 är skillnaden i uttryck av GPR 41 och GPR 43. Baserat på de förväntade skillnaderna i tarmmikrobiotaprofilen och efterföljande SCFA-produktion förväntar vi oss en skillnad på 25 % mellan PPI-användare och icke-användare för båda resultaten, vilket ger oss 99 % kraft för både Mål 2 och 3). Vi kommer även att utföra undergruppsanalyser inom NW- och OB-grupperna.