PPI 요법이 체중, 장내 마이크로바이옴, GPR41 및 GPR43의 발현에 미치는 영향

연구 계획:

UCH 내시경검사실에서 선별검사 또는 감시 대장내시경검사(결장직장암의 경우)가 예정된 위장관 증상이 없는 환자는 포함 및 제외 기준에 따라 연구를 위해 선별될 것입니다. 연구에 동의하는 적격 환자는 신장, 체중 및 인구통계학적 정보를 측정하고 기록하게 됩니다. 그들은 체중/식이력 설문지를 작성할 것입니다. 환자는 일상적인 임상 치료에 따라 선별/감시 대장내시경 검사를 받게 됩니다. 폴립 검출을 향상시키기 위해 점막의 전체 시각화를 보장하기 위해 대장 내시경을 통해 잔여 대변을 표준으로 흡인합니다. S결장, 맹장, 회장 말단의 세 곳에서 대변을 흡인합니다. 증거에 따르면 장 준비(대장 내시경 검사 전)는 대부분의 피험자의 장내 미생물 구성을 크게 변화시키지 않습니다. 우리는 또한 이 세 곳에서 각각 4개의 작은 핀치 생검을 할 것입니다. 대변 ​​흡인액 및 생검 표본은 액체 N2에서 급속 냉동되고 분석에 필요할 때까지 -80C에서 냉동됩니다.

OB/PPI, OB/비PPI, NW/PPI 및 NW/비PPI의 4개 그룹 간에 균등하게 나누어 총 48명의 피험자를 등록합니다. 위의 포함/제외 기준을 충족하는 주당 약 40-50명의 환자가 UCH에서 선별/감시 대장내시경 검사를 받으며, 6-9개월 동안 주당 2-3명의 환자를 모집하여 목표 등록에 도달하도록 합니다.

목표 1: 정상 체중(NW) 및 비만(OB) 환자의 결장 및 말단 회장에서 장내 미생물에 대한 PPI 사용의 효과를 조사합니다. 장내 미생물군은 16S rRNA 시퀀싱으로 프로파일링되어 장내 생물 다양성의 PPI 관련 변경을 식별합니다.

S결장, 맹장 및 말단 회장의 대변 흡인 및 점막 생검을 위해 별도의 멸균 검체 수집 용기가 사용됩니다. 마이크로바이옴 분석을 위한 고처리량 DNA 시퀀싱이 사용됩니다.

Microbiome 16S rRNA 프로파일링 전체 커뮤니티 게놈 DNA는 장 표본과 앞에서 설명한 대로 PCR 증폭된 16S rRNA 유전자로부터 준비됩니다. 쌍방향 다중 시퀀싱이 수행됩니다. 1000만~2000만 개의 DNA 시퀀스가 ​​단일 실행에서 생성되고 샘플당 100,000개의 rRNA 판독이 생성되어 >99% 시퀀스 커버리지를 보장합니다. 역다중화, 품질 필터링, 키메라 제거 및 서열 분류(SINA/Silva 사용)는 이전 간행물을 따를 것입니다. 유사한 시퀀스는 분류법을 기반으로 운영 분류 단위(OTU)로 그룹화됩니다.

Microbiome 데이터 분석 주요 결과는 미생물 그룹의 상대 풍부도(PRA)이며, 이것이 PPI 사용자와 위산 억제 약물 비사용자 간에 다를 것이라고 가정합니다. 실험 그룹 간에 다른 특정 미생물 그룹(종/속/문)은 비모수적 두 부분 통계를 사용하여 식별됩니다.40 통계 분석은 = 0.05에서 평가되며 p-값은 FDR(False Discovery Rate)에 대해 수정됩니다.41 결과는 종별 QPCR에 의해 검증됩니다.

목표 2: PPI 사용이 NW 및 OB 개인의 발효 주기에 전용된 장내 세균 RNA의 상대적 양을 변경하는지 여부를 결정합니다. 우리는 PPI 환자에서 차별적으로 발현되는 미생물 대사 경로를 식별하기 위해 장내 미생물로부터 준비된 벌크 RNA의 샷건 시퀀싱을 수행할 것입니다. 말단 회장, 맹장 및 S상 결장으로부터의 대변 흡인은 위에서 설명한 대로 얻어질 것입니다.

RNA 분리 및 시퀀싱 미생물 RNA는 RiboPure Bacteria 추출 키트(Life Technologies Inc., USA)를 사용하여 분변 흡인물 50mg에서 추출됩니다. 이 파일럿에서는 OB/PPI, OB/비 PPI, NW/PPI 및 NW/비 PPI의 4개 그룹으로 균등하게 나누어 총 48명의 피험자로부터 검체를 분석할 것입니다. 숙주 및 미생물 rRNA는 Ribo-Zero 박테리아 및 Ribo-Zero 마우스 키트(Epicentre, Inc, USA)를 사용하여 제거됩니다. ScriptSeq v2 RNA-Seq(박테리아) 키트(Epicentre, Inc, USA)를 사용하여 시퀀싱을 위해 RNA 샘플을 준비합니다. 시퀀싱은 높은 적용 범위를 제공하는 Illumina HiSeq2000 플랫폼(UC-Denver Microarray 및 Genomics Core)에서 수행됩니다. 재현성의 품질 보증을 위해 각 표본의 두 개의 mRNA 샘플을 모아서 시퀀싱합니다. 이 파일럿 실험에서는 각 미생물 메타 전사체 데이터 세트에 대해 샘플당 ~20x106 단일 말단 150개 염기 읽기를 생성합니다.

Metatranscriptome 데이터 분석 GenBank에서 현재 사용 가능한 약 1800개의 박테리아 게놈 서열에 대한 BLASTX 검색과 <10- 5.44 COG,47 KEGG48 및 RAST/SEED 도구49를 통해 생성된 주석을 사용하여 샘플 간의 광범위한 기능적 차이를 평가합니다. 50 장내 미생물 전사체의 통계적 분석은 그룹 간에 차별적으로 발현되는 대사 경로의 식별에 초점을 맞출 것입니다.44 고품질 주석(E<10-5)이 있는 유전자는 주어진 유전자 및 대상에 대해 주석이 달린 시퀀스 판독 수를 기록하는 대상(N)에 의해 유전자(M)의 NxM 매트릭스를 구성하는 데 사용됩니다. 피험자(N)에 의한 유전자 범주(M)의 유사한 NxM 매트릭스를 구성하여 기능적 범주에 할당된 서열 판독의 분포를 표로 만들 것입니다. 처리군 사이에 유병률 또는 풍부도가 다른 유전자 또는 유전자 범주는 각각 매트릭스의 각 유전자/범주에 적용된 Fisher 정확 검정 또는 Kruskal-Wallis 검정에 의해 식별될 것입니다. 유의성은 FDR에 대한 보정 후 = 0.05에서 평가될 것입니다. P-값은 전체 환자 코호트에 걸쳐 유전자 발현을 스크리닝하기 위해 QPCR을 사용하여 후속 검증을 위한 후보 유전자 목록의 우선 순위를 지정하는 데 사용될 것입니다.

목표 3: PPI 사용이 NW 및 OB 환자의 결장 및 말단 회장에서 GPR41, GPR43 및 이펙터 유전자의 발현을 변경하는 정도를 결정합니다. 생검 표본은 미생물 SCFA 생산에 의해 영향을 받는 표적 유전자의 발현을 모니터링하기 위해 RT-QPCR 분석 패널에 적용됩니다. 말단 회장, 맹장 및 S상 결장에서 생검을 위에서 설명한 대로 얻을 것입니다.

정량적 역전사효소-PCR(qRT-PCR) 분석 RNeasy Mini Kit(Qiagen) 및 ISOGEN(WAKO)을 사용하여 총 RNA를 추출합니다. 상보적 DNA는 Moloney 쥐 백혈병 바이러스 역전사 효소(Invitrogen)를 사용하여 RNA를 주형으로 사용하여 전사됩니다. cDNA는 적절한 프라이머를 사용하여 Taq DNA polymerase(TaKaRa)로 PCR을 통해 증폭됩니다. qRT-PCR 분석은 DNA Engine Opticon-2(MJ Research)를 사용하여 수행됩니다. 표현은 중복으로 정량화됩니다.

샘플 크기 및 검정력 분석:

24명의 NW 및 24명의 비만(OB) 참가자를 등록합니다. NW 및 OB 그룹의 절반은 PPI 사용자이고 절반은 제산제 비사용자입니다. 목표 1의 주요 결과는 Firmicutes와 Bacteroidetes의 PRA 차이입니다. 양방향 ANOVA(BMI 범주 및 PPI 사용 요인)가 사용됩니다. 예비 데이터를 기반으로, 우리는 Firmicutes의 PRA 차이를 감지하는 94%의 검정력(SD 20%에서 72% 대 52%)과 Bacteroidetes의 PRA 차이를 감지하는 검정력 95%(16% 대 5 %, SD 5%) PPI 사용자와 비사용자 사이. 목표 2의 주요 결과는 발효 주기 전용 박테리아 RNA의 차이이고 목표 3의 결과는 GPR 41과 GPR 43의 발현 차이입니다. 장내 미생물 프로필과 후속 SCFA 생산에서 예상되는 차이를 기반으로 PPI 사용자와 비사용자 간에 두 결과 모두 25%의 차이가 있을 것으로 예상하여 목표 2와 3 모두에 대해 99%의 힘을 제공합니다. 또한 NW 및 OB 그룹 내에서 하위 그룹 분석을 수행합니다.