A PPI terápia hatása a testsúlyra, a bél mikrobiomára és a GPR41 és GPR43 expressziójára

Kutatási terv:

Az UCH endoszkópos laboratóriumában szűrővizsgálatra vagy megfigyelő kolonoszkópiára (kolorektális rák miatt) tervezett, gyomor-bélrendszeri tünetekkel nem rendelkező betegeket a felvételi és kizárási kritériumok alapján szűrik a vizsgálatra. Azon jogosult betegeknél, akik beleegyeznek a vizsgálatba, megmérik és rögzítik a magasságot, testsúlyt és demográfiai adatokat. Ki kell tölteni egy testsúly/étrendtörténeti kérdőívet. A betegeket a rutin klinikai ellátás során szűrő/megfigyelő kolonoszkópiának vetik alá. A maradék székletet szokásosan a kolonoszkópon keresztül szívják fel, hogy biztosítsák a nyálkahártya teljes vizualizálását, és ezáltal javítsák a polipok kimutatását. Három különböző helyről veszünk székletszívást: szigmabélből, vakbélből és terminális ileumból. A bizonyítékok arra utalnak, hogy a bélelőkészítés (a kolonoszkópia előtt) nem változtatja meg jelentősen a bélmikrobióta összetételét az alanyok többségénél. Mind a három helyen négy kis, csipetnyi biopsziát is veszünk. A széklet aspirátumait és a biopsziás mintákat pillanatok alatt lefagyasztják folyékony N2-ben, és -80 C-on lefagyasztják, amíg a vizsgálatokhoz szükségük lesz rá.

Összesen 48 alanyt veszünk fel, egyenlően osztva négy csoport között: OB/PPI, OB/non-PPI, NW/PPI és NW/non-PPI. Hetente hozzávetőlegesen 40-50, a fenti beválasztási/kizárási kritériumoknak megfelelő beteg esik át szűrővizsgálaton/megfigyelő kolonoszkópián az UCH-n, így 6-9 hónapon keresztül heti 2-3 beteg toborzása reális a célzott beiratkozás elérése érdekében.

1. cél: A PPI használatának a bél mikrobiotára gyakorolt ​​hatásának vizsgálata normál súlyú (NW) és elhízott (OB) betegek vastag- és terminális ileumában. A bélmikrobiómákat 16S rRNS szekvenálással profilálják, hogy azonosítsák a PPI-vel összefüggő változásokat a bél biodiverzitásában.

Külön steril mintagyűjtő edényeket használnak a széklet aspirátumaihoz és a nyálkahártya biopsziához a szigmabélből, a vakbélből és a terminális csípőbélből. A mikrobiom elemzéséhez nagy áteresztőképességű DNS-szekvenálást fognak használni.

A mikrobiom 16S rRNS profilozása A teljes közösség genomiális DNS-ét bélmintákból és a korábban leírtak szerint PCR-amplifikált 16S rRNS génekből állítják elő. Páros végű, multiplex szekvenálás kerül végrehajtásra. Egyetlen futtatással 10-20 millió DNS-szekvencia jön létre, és mintánként 100 000 rRNS-leolvasás történik a 99%-os szekvencialefedettség biztosítása érdekében. A demultiplexelés, a minőségi szűrés, a kiméra eltávolítás és a szekvencia osztályozás (SINA/Silva használatával) a korábbi publikációkat követi. A hasonló sorozatokat a taxonómia alapján operatív taxonómiai egységekbe (OTU) csoportosítják.

Mikrobióma adatok elemzése A fő eredmény a mikrobiális csoportok százalékos relatív abundanciája (PRA), és feltételezzük, hogy ez különbözni fog a PPI-t használók és a savcsökkentő gyógyszereket nem használók között. A kísérleti csoportok között eltérő specifikus mikrobiális csoportokat (faj/nemzetség/fila) egy nem-paraméteres, kétrészes statisztika segítségével azonosítjuk. A statisztikai elemzések értéke = 0,05, és a p-értékeket hamis felfedezési arányra (FDR) korrigáljuk.41 Az eredményeket fajspecifikus QPCR-rel validáljuk.

2. cél: Annak meghatározása, hogy a PPI-használat megváltoztatja-e a bélbaktérium RNS-ének relatív mennyiségét, amely a fermentációs ciklushoz kötődik NW és OB egyedekben. A bélmikrobiómákból előállított bulk RNS sörétes szekvenálását végezzük, hogy azonosítsuk a PPI-t szedő betegekben eltérően expresszálódó mikrobiális metabolikus útvonalakat. A széklet leszívása a terminális ileumból, a vakbélből és a szigmabélből a fent részletezett módon történik.

RNS izolálás és szekvenálás A mikrobiális RNS-t a RiboPure Bacteria extrakciós készlet (Life Technologies Inc., USA) segítségével 50 mg székletszívóból vonják ki. Ebben a kísérletben összesen 48 alany mintáit vizsgáljuk meg egyenlő arányban négy csoport között: OB/PPI, OB/nem PPI, NW/PPI és NW/non-PPI. A gazda- és mikrobiális rRNS-t a Ribo-Zero baktériumok és a Ribo-Zero egérkészletek (Epicenre, Inc., USA) segítségével távolítják el. Az RNS-mintákat a ScriptSeq v2 RNA-Seq (baktérium) kittel (Epicentre, Inc., USA) készítik elő szekvenáláshoz. A szekvenálást Illumina HiSeq2000 platformon (UC-Denver Microarray és Genomics Core) végezzük, amely nagy lefedettséget biztosít. A reprodukálhatóság minőségének biztosítása érdekében minden mintából két-két mRNS-mintát egyesítenek és szekvenálnak. Ebben a kísérleti kísérletben ~20x106 egyvégű, 150 bázisú leolvasást generálunk mintánként minden mikrobiális metatranszkriptom adatkészlethez.

A metatranszkriptom adatok elemzése A bakteriális transzkriptumok annotálása és számbavétele peptidszinten történik BLASTX-kereséssel a GenBankban jelenleg elérhető körülbelül 1800 bakteriális genom szekvenciával, valamint az NCBI nem redundáns fehérje adatbázisával, 10-nél kisebb E-érték határértékkel. 5.44 A minták közötti széles körű funkcionális különbségeket a COG,47 KEGG48 és a RAST/SEED eszközökkel generált annotációk segítségével értékeljük.49, 50 Az enterális mikrobiális transzkriptomok statisztikai elemzése a csoportok között eltérően expresszálódó metabolikus útvonalak azonosítására fog összpontosítani.44 A jó minőségű annotációkkal rendelkező géneket (E<10-5) az alanyok (N) NxM génmátrixának (M) felépítéséhez használják fel, amely rögzíti az adott génre és alanyra vonatkozó megjegyzésekkel ellátott szekvencialeolvasások számát. Az alanyok (N) szerinti génkategóriáinak (M) hasonló NxM mátrixát készítjük el, hogy táblázatba foglaljuk a funkcionális kategóriákhoz rendelt szekvencialeolvasások eloszlását. Azokat a géneket vagy génkategóriákat, amelyek prevalenciájában vagy bőségében különböznek a kezelési csoportok között, a Fisher-féle egzakt teszt vagy a Kruskal-Wallis teszt azonosítja, amelyeket a mátrix minden génjére/kategóriájára alkalmaznak. A szignifikancia értéke = 0,05, majd az FDR.41 P-értékek korrekcióját követően a jelölt génlistát a QPCR-rel történő utókövetési validáláshoz a génexpresszió szűrésére a teljes betegcsoportban.

3. cél: Annak meghatározása, hogy a PPI-használat milyen mértékben változtatja meg a GPR41, GPR43 és effektor génjeik expresszióját NW és OB betegek vastagbélében és terminális csípőbélében. A biopsziás mintákat RT-QPCR vizsgálati panelnek vetik alá a mikrobiális SCFA-termelés által befolyásolt célgének expressziójának nyomon követésére. A terminális csípőbélből, a vakbélből és a szigmabélből biopsziát veszünk a fent részletezett módon.

Kvantitatív reverz transzkriptáz-PCR (qRT-PCR) elemzés A teljes RNS-t az RNeasy Mini Kit (Qiagen) és az ISOGEN (WAKO) segítségével extraháljuk. A komplementer DNS-eket a Moloney egér leukémia vírus reverz transzkriptáz (Invitrogen) segítségével templátként RNS-ek segítségével írják át. A cDNS-eket PCR-rel amplifikáljuk Taq DNS polimerázzal (TaKaRa) a megfelelő primerek felhasználásával. A qRT-PCR elemzéseket a DNA Engine Opticon-2 (MJ Research) segítségével végezzük. A kifejezés két példányban lesz számszerűsítve.

Mintaméret és teljesítményelemzés:

24 NW és 24 elhízott (OB) résztvevőt írunk be. Az NW és OB csoportok fele PPI-használó, fele pedig nem használ savcsökkentő gyógyszereket. Az 1. cél elsődleges eredménye a Firmicutes és Bacteroidetes PRA különbsége. Kétirányú ANOVA-t (a BMI-kategória és a PPI-használat tényezői) alkalmaznak. Előzetes adataink alapján 94%-os képességünk lesz kimutatni a különbséget a Firmicutes PRA-jában (72% vs 52% SD 20%) és 95% -os képességünk a Bacteroidetes PRA különbségeinek kimutatására (16% vs 5). % 5%-os SD-vel a PPI-t használók és a nem használók között. A 2. cél elsődleges eredménye a fermentációs ciklusnak szentelt bakteriális RNS különbsége, míg a 3. cél eredménye a GPR 41 és GPR 43 expressziójának különbsége. A bélmikrobióta profiljában és az azt követő SCFA-termelésben várható különbségek alapján 25%-os különbséget várunk a PPI-t használók és a nem használók között mindkét eredmény esetében, ami 99%-os teljesítményt biztosít a 2. és 3. cél esetében egyaránt. Az ÉNy-i és az OB-csoporton belül is alcsoportelemzéseket fogunk végezni.