El efecto de la terapia con IBP sobre el peso, el microbioma intestinal y la expresión de GPR41 y GPR43

Plan de investigación:

Los pacientes sin síntomas gastrointestinales programados para una colonoscopia de detección o vigilancia (por cáncer colorrectal) en el laboratorio de endoscopia de la UCH serán evaluados para el estudio según los criterios de inclusión y exclusión. A los pacientes elegibles que den su consentimiento para el estudio se les medirá y registrará la altura, el peso y la información demográfica. Completarán un cuestionario de historial de peso/dieta. Los pacientes se someterán a la colonoscopia de detección/vigilancia según la atención clínica de rutina. Las heces residuales se aspiran de forma estándar a través del colonoscopio para garantizar una visualización completa de la mucosa y mejorar la detección de pólipos. Tomaremos aspirados de heces de tres lugares separados: colon sigmoide, ciego e íleon terminal. La evidencia sugiere que una preparación intestinal (antes de la colonoscopia) no cambia significativamente la composición de la microbiota intestinal para la mayoría de los sujetos. También tomaremos cuatro biopsias pequeñas de pellizco en cada uno de estos tres sitios. Los aspirados de heces y las muestras de biopsia se congelarán instantáneamente en N2 líquido y se congelarán a -80 °C hasta que se requieran para sus ensayos.

Inscribiremos un total de 48 sujetos divididos equitativamente entre cuatro grupos: OB/PPI, OB/non-PPI, NW/PPI y NW/non-PPI. Aproximadamente 40-50 pacientes por semana que cumplen con los criterios de inclusión/exclusión anteriores se someten a una colonoscopia de detección/vigilancia en la UCH, lo que hace que el reclutamiento de 2-3 pacientes/semana durante 6-9 meses sea realista para alcanzar la inscripción objetivo.

Objetivo 1: Examinar los efectos del uso de PPI en la microbiota intestinal en el colon y el íleon terminal de pacientes con peso normal (NW) y obesos (OB). Los microbiomas intestinales se perfilarán mediante la secuenciación del ARNr 16S para identificar las alteraciones asociadas con PPI en la biodiversidad intestinal.

Se utilizarán recipientes de recogida de muestras estériles independientes para los aspirados de heces y las biopsias de la mucosa del colon sigmoide, el ciego y el íleon terminal. Se utilizará la secuenciación de ADN de alto rendimiento para el análisis de microbiomas.

Perfilado del microbioma 16S rRNA El ADN genómico total de la comunidad se preparará a partir de muestras intestinales y los genes 16S rRNA amplificados por PCR como se describió anteriormente. Se realizará una secuenciación multiplexada de extremos emparejados. Se generarán entre 10 y 20 millones de secuencias de ADN en una sola ejecución y se generarán 100 000 lecturas de ARNr por muestra para garantizar una cobertura de secuencia >99 %. La demultiplexación, el filtrado de calidad, la eliminación de quimeras y la clasificación de secuencias (utilizando SINA/Silva) seguirán a las publicaciones anteriores. Las secuencias similares se agrupan en unidades taxonómicas operativas (OTU) según la taxonomía.

Análisis de datos del microbioma El resultado principal es el porcentaje de abundancia relativa (PRA) de los grupos microbianos, y suponemos que esto diferirá entre los usuarios de PPI y los no usuarios de medicamentos para la supresión de ácido. Los grupos microbianos específicos (especies/géneros/phyla) que difieren entre los grupos experimentales se identificarán utilizando una estadística no paramétrica de dos partes.40 Los análisis estadísticos se evaluarán en = 0,05 y los valores de p se corregirán para la tasa de descubrimiento falso (FDR).41 Los resultados se validarán mediante QPCR específica de especie.

Objetivo 2: Determinar si el uso de PPI altera la cantidad relativa de ARN bacteriano intestinal dedicado al ciclo de fermentación en individuos NW y OB. Realizaremos una secuenciación rápida de ARN a granel preparado a partir de microbiomas intestinales para identificar vías metabólicas microbianas expresadas diferencialmente en pacientes con IBP. Se obtendrán aspirados de heces del íleon terminal, ciego y colon sigmoide como se detalla anteriormente.

Aislamiento y secuenciación de ARN El ARN microbiano se extraerá de 50 mg de aspirados fecales mediante el kit de extracción RiboPure Bacteria (Life Technologies Inc., EE. UU.). Para este piloto, analizaremos muestras de un total de 48 sujetos divididos equitativamente entre cuatro grupos: OB/PPI, OB/no PPI, NW/PPI y NW/no PPI. El rRNA microbiano y del huésped se eliminará utilizando los kits de bacterias Ribo-Zero y de ratón Ribo-Zero (Epicentre, Inc, EE. UU.). Las muestras de ARN se prepararán para la secuenciación utilizando los kits ScriptSeq v2 RNA-Seq (bacteria) (Epicentre, Inc, EE. UU.). La secuenciación se realizará en una plataforma Illumina HiSeq2000 (UC-Denver Microarray and Genomics Core), que proporciona una cobertura de gran profundidad. Para garantizar la calidad de la reproducibilidad, se agruparán y secuenciarán dos muestras de ARNm de cada espécimen. En este experimento piloto, generaremos ~20x106 lecturas de 150 bases de un solo extremo por muestra para cada conjunto de datos de metatranscriptoma microbiano.

Análisis de datos de metatranscriptoma La anotación y la enumeración de transcritos bacterianos se realizarán a nivel de péptido utilizando búsquedas BLASTX en las aproximadamente 1800 secuencias del genoma bacteriano actualmente disponibles en GenBank, así como en la base de datos de proteínas no redundantes del NCBI utilizando un límite de valor E de <10- 5.44 Las diferencias funcionales de amplio nivel entre las muestras se evaluarán utilizando anotaciones generadas a través de las herramientas COG,47 KEGG48 y RAST/SEED.49, 50 El análisis estadístico de transcriptomas microbianos entéricos se centrará en la identificación de vías metabólicas que se expresan de manera diferencial entre grupos.44 Los genes con anotaciones de alta calidad (E<10-5) se utilizarán para construir una matriz NxM de genes (M) por sujetos (N) que registren el número de lecturas de secuencia anotadas para un gen y un sujeto determinados. Se construirá una matriz NxM similar de categorías de genes (M) por sujetos (N) para tabular la distribución de lecturas de secuencia asignadas a categorías funcionales. Los genes o categorías de genes que difieren en prevalencia o abundancia entre los grupos de tratamiento se identificarán mediante la prueba exacta de Fisher o la prueba de Kruskal-Wallis, respectivamente, aplicada a cada gen/categoría en la matriz. La importancia se evaluará en = 0,05, luego de la corrección de FDR.41 Los valores P se usarán para priorizar una lista de genes candidatos para la validación de seguimiento usando QPCR para detectar la expresión génica en toda la cohorte de pacientes.

Objetivo 3: Determinar en qué medida el uso de PPI altera la expresión de GPR41, GPR43 y sus genes efectores en el colon y el íleon terminal de pacientes NW y OB. Las muestras de biopsia se someterán a un panel de ensayos RT-QPCR para monitorear la expresión de los genes objetivo afectados por la producción microbiana de SCFA. Se obtendrán biopsias del íleon terminal, ciego y colon sigmoide como se detalla anteriormente.

Análisis cuantitativo de transcriptasa inversa-PCR (qRT-PCR) El ARN total se extraerá utilizando el RNeasy Mini Kit (Qiagen) e ISOGEN (WAKO). Los ADN complementarios se transcribirán usando ARN como moldes con la transcriptasa inversa del virus de la leucemia murina de Moloney (Invitrogen). Los cDNA se amplificarán mediante PCR con Taq DNA polimerasa (TaKaRa) utilizando los cebadores apropiados. Los análisis qRT-PCR se realizarán utilizando DNA Engine Opticon-2 (MJ Research). La expresión se cuantificará por duplicado.

Tamaño de muestra y análisis de potencia:

Inscribiremos a 24 NW y 24 participantes obesos (OB). La mitad de los grupos NW y OB serán usuarios de PPI y la otra mitad no usuarios de medicamentos supresores de ácido. El resultado primario para el Objetivo 1 es la diferencia en el PRA de Firmicutes y Bacteroidetes. Se utilizará un ANOVA de dos vías (factores de categoría de IMC y uso de PPI). Según nuestros datos preliminares, tendremos un poder del 94 % para detectar una diferencia en el PRA de Firmicutes (72 % frente al 52 % con SD del 20 %) y un poder del 95 % para detectar diferencias en el PRA de Bacteroidetes (16 % frente a 5 % con SD del 5%) entre usuarios y no usuarios del PPI. El resultado principal del Objetivo 2 es la diferencia en el ARN bacteriano dedicado al ciclo de fermentación, mientras que el resultado del Objetivo 3 es la diferencia en la expresión de GPR 41 y GPR 43. Según las diferencias esperadas en el perfil de la microbiota intestinal y la posterior producción de SCFA, esperamos una diferencia del 25 % entre los usuarios de PPI y los no usuarios para ambos resultados, lo que nos da un poder del 99 % para los Objetivos 2 y 3). También realizaremos análisis de subgrupos dentro de los grupos NW y OB.