Vliv terapie PPI na hmotnost, střevní mikrobiom a expresi GPR41 a GPR43

Výzkumný plán:

Pacienti bez gastrointestinálních příznaků naplánovaných na screeningovou nebo kontrolní kolonoskopii (pro kolorektální karcinom) v endoskopické laboratoři UCH budou vyšetřeni do studie na základě kritérií pro zařazení a vyloučení. Způsobilým pacientům, kteří souhlasí se studií, se změří a zaznamená výška, hmotnost a demografické informace. Vyplní dotazník o váze/stravování. Pacienti podstoupí screeningovou/dohledovou kolonoskopii v rámci běžné klinické péče. Zbytková stolice je standardně odsávána kolonoskopem, aby byla zajištěna úplná vizualizace sliznice pro zlepšení detekce polypů. Odebereme aspiráty stolice ze tří samostatných míst: sigmoidálního tračníku, slepého střeva a terminálního ilea. Důkazy naznačují, že příprava střeva (před kolonoskopií) u většiny subjektů významně nemění složení střevní mikroflóry. Také provedeme čtyři malé biopsie na každém z těchto tří míst. Aspiráty stolice a bioptické vzorky budou bleskově zmraženy v tekutém N2 a zmraženy při -80 °C, dokud je nebudou nutné pro jejich testy.

Zapíšeme celkem 48 předmětů rovnoměrně rozdělených do čtyř skupin: OB/PPI, OB/non-PPI, NW/PPI a NW/non-PPI. Přibližně 40–50 pacientů týdně, kteří splňují výše uvedená kritéria pro zařazení/vyloučení, podstoupí screeningovou/dohledovou kolonoskopii na UCH, díky čemuž je reálný nábor 2–3 pacientů/týden po dobu 6–9 měsíců k dosažení cíleného zařazení.

Cíl 1: Zkoumat účinky použití PPI na střevní mikroflóru v tlustém střevě a terminálním ileu u pacientů s normální hmotností (NW) a obézních (OB). Střevní mikrobiomy budou profilovány sekvenováním 16S rRNA, aby se identifikovaly změny v biodiverzitě střev spojené s PPI.

Pro aspiráty stolice a slizniční biopsie z esovitého tračníku, slepého střeva a terminálního ilea budou použity samostatné sterilní nádobky na odběr vzorků. Pro analýzu mikrobiomů bude použito vysoce výkonné sekvenování DNA.

Profilování 16S rRNA mikrobiomu Celková komunitní genomová DNA bude připravena ze střevních vzorků a genů 16S rRNA PCR amplifikovaná, jak bylo popsáno výše. Bude provedeno párové, multiplexované sekvenování. V jednom běhu bude vytvořeno 10-20 milionů sekvencí DNA a 100 000 čtení rRNA na vzorek, aby bylo zajištěno >99% pokrytí sekvence. Demultiplexování, filtrování kvality, odstraňování chimér a klasifikace sekvencí (pomocí SINA/Silva) budou následovat po předchozích publikacích. Podobné sekvence jsou seskupeny do operačních taxonomických jednotek (OTU) na základě taxonomie.

Analýza dat mikrobiomu Hlavním výsledkem je procento relativní četnosti (PRA) mikrobiálních skupin a předpokládáme, že se bude lišit mezi uživateli PPI a neuživateli léků na potlačení kyselosti. Specifické mikrobiální skupiny (druhy/rody/fyla), které se liší mezi experimentálními skupinami, budou identifikovány pomocí neparametrické dvoudílné statistiky.40 Statistické analýzy budou vyhodnoceny při = 0,05 a p-hodnoty korigovány na míru falešných objevů (FDR).41 Výsledky budou ověřeny druhově specifickou QPCR.

Cíl 2: Zjistit, zda použití PPI mění relativní množství střevní bakteriální RNA vyhrazené pro fermentační cyklus u jedinců NW a OB. Provedeme sekvenování hromadné RNA připravené ze střevních mikrobiomů, abychom identifikovali mikrobiální metabolické dráhy odlišně exprimované u pacientů na PPI. Aspiráty stolice z terminálního ilea, slepého střeva a sigmoidálního tračníku budou získány, jak je podrobně popsáno výše.

Izolace a sekvenování RNA Mikrobiální RNA bude extrahována z 50 mg fekálních aspirátů pomocí extrakční sady RiboPure Bacteria (Life Technologies Inc., USA). Pro tento pilotní test budeme testovat vzorky od celkem 48 subjektů rozdělených rovnoměrně do čtyř skupin: OB/PPI, OB/non-PPI, NW/PPI a NW/non-PPI. Hostitelská a mikrobiální rRNA budou odstraněny pomocí souprav pro bakterie Ribo-Zero a Ribo-Zero pro myši (Epicentre, Inc, USA). Vzorky RNA budou připraveny pro sekvenování pomocí souprav ScriptSeq v2 RNA-Seq (bakterie) (Epicentre, Inc, USA). Sekvenování bude provedeno na platformě Illumina HiSeq2000 (UC-Denver Microarray and Genomics Core), která poskytuje vysokou hloubku pokrytí. Pro zajištění kvality reprodukovatelnosti budou dva vzorky mRNA z každého vzorku spojeny a sekvenovány. V tomto pilotním experimentu vygenerujeme ~20x106 jednokoncových 150bázových čtení na vzorek pro každý soubor dat mikrobiálního meta-transkriptomu.

Analýza metatranskriptomových dat Anotace a vyčíslení bakteriálních transkriptů bude provedeno na úrovni peptidů pomocí vyhledávání BLASTX proti přibližně 1800 sekvencím bakteriálního genomu, které jsou v současné době dostupné v GenBank, a také databázi neredundantních proteinů NCBI s použitím mezní hodnoty E <10- 5.44 Funkční rozdíly na široké úrovni mezi vzorky budou posouzeny pomocí anotací generovaných pomocí nástrojů COG,47 KEGG48 a RAST/SEED.49, 50 Statistická analýza střevních mikrobiálních transkriptomů se zaměří na identifikaci metabolických drah, které jsou mezi skupinami rozdílně vyjádřeny.44 Geny s vysoce kvalitními anotacemi (E<10-5) budou použity ke konstrukci NxM matice genů (M) subjekty (N) zaznamenávajícími počet čtení sekvencí anotovaných pro daný gen a subjekt. Podobná matice NxM kategorií genů (M) subjekty (N) bude zkonstruována pro tabelování distribuce čtení sekvencí přiřazených funkčním kategoriím. Geny nebo kategorie genů, které se liší v prevalenci nebo abundanci mezi léčenými skupinami, budou identifikovány Fisherovým exaktním testem nebo Kruskal-Wallisovým testem, v daném pořadí, aplikovanými na každý gen/kategorii v matrici. Významnost bude hodnocena při = 0,05, po korekci na FDR.41 P-hodnoty budou použity k upřednostnění seznamu kandidátních genů pro následnou validaci pomocí QPCR ke screeningu genové exprese v celé kohortě pacientů.

Cíl 3: Zjistit, do jaké míry použití PPI mění expresi GPR41, GPR43 a jejich efektorových genů v tlustém střevě a terminálním ileu pacientů s NW a OB. Bioptické vzorky budou podrobeny panelu testů RT-QPCR pro monitorování exprese cílových genů ovlivněných produkcí mikrobiálních SCFA. Biopsie z terminálního ilea, slepého střeva a sigmoidního tračníku budou získány, jak je podrobně popsáno výše.

Analýza kvantitativní reverzní transkriptázou-PCR (qRT-PCR) Celková RNA bude extrahována pomocí RNeasy Mini Kit (Qiagen) a ISOGEN (WAKO). Komplementární DNA budou transkribovány pomocí RNA jako templátů pomocí reverzní transkriptázy viru myší leukémie Moloney (Invitrogen). cDNA budou amplifikovány pomocí PCR s Taq DNA polymerázou (TaKaRa) za použití vhodných primerů. qRT-PCR analýzy budou provedeny pomocí DNA Engine Opticon-2 (MJ Research). Výraz bude kvantifikován duplicitně.

Analýza velikosti a výkonu vzorku:

Zapíšeme 24 NW a 24 obézních (OB) účastníků. Polovina skupin NW a OB budou uživatelé PPI a polovina nebudou uživatelé léků potlačujících kyselost. Primárním výsledkem pro Cíl 1 je rozdíl v PRA Firmicutes a Bacteroidetes. Bude použita dvoucestná ANOVA (faktory kategorie BMI a použití PPI). Na základě našich předběžných údajů budeme mít 94% schopnost detekovat rozdíl v PRA u Firmicutes (72 % oproti 52 % s SD 20 %) a 95 % schopnost detekovat rozdíly v PRA u Bacteroidetes (16 % oproti 5 % s SD 5 %) mezi uživateli PPI a neuživateli. Primárním výsledkem pro cíl 2 je rozdíl v bakteriální RNA vyhrazené pro fermentační cyklus, zatímco výsledkem pro cíl 3 je rozdíl v expresi GPR 41 a GPR 43. Na základě očekávaných rozdílů v profilu střevní mikroflóry a následné produkci SCFA očekáváme 25% rozdíl mezi uživateli PPI a neuživateli pro oba výsledky, což nám dává 99% sílu pro oba cíle 2 a 3). Provedeme také podskupinové analýzy v rámci skupin NW a OB.