Effekten av PPI-terapi på vekt, tarmmikrobiom og uttrykk for GPR41 og GPR43

Forskningsplan:

Pasienter uten gastrointestinale symptomer som er planlagt for en screening eller overvåking av koloskopi (for kolorektal kreft) ved UCH endoskopilaboratoriet vil bli screenet for studien basert på inklusjons- og eksklusjonskriteriene. Kvalifiserte pasienter som samtykker til studien vil ha høyde, vekt og demografisk informasjon målt og registrert. De vil fylle ut et spørreskjema om vekt/dietthistorie. Pasienter vil gjennomgå screening/overvåking koloskopi per rutinemessig klinisk behandling. Resterende avføring aspireres standard gjennom koloskopet for å sikre full visualisering av slimhinnen for å forbedre polyppdeteksjon. Vi vil ta avføringsaspirater fra tre separate steder: sigmoid colon, cecum og terminal ileum. Bevis tyder på at en tarmforberedelse (før koloskopi) ikke endrer sammensetningen av tarmmikrobiotaen signifikant for de fleste forsøkspersonene. Vi vil også ta fire små knipebiopsier på hvert av disse tre stedene. Avføringsaspirater og biopsiprøver vil bli hurtigfrosset i flytende N2 og frosset ved -80C til det kreves for analysene.

Vi vil registrere totalt 48 forsøkspersoner fordelt likt mellom fire grupper: OB/PPI, OB/ikke-PPI, NW/PPI og NW/ikke-PPI. Omtrent 40-50 pasienter per uke som oppfyller de ovennevnte inklusjons-/eksklusjonskriteriene gjennomgår en screening/overvåkingskoloskopi ved UCH, noe som gjør rekruttering av 2-3 pasienter/uke over 6-9 måneder realistisk for å nå målrettet innrullering.

Mål 1: Å undersøke effekten av PPI-bruk på tarmmikrobiotaen i tykktarmen og terminal ileum hos normalvektige (NW) og overvektige (OB) pasienter. Intestinale mikrobiomer vil bli profilert ved 16S rRNA-sekvensering for å identifisere PPI-assosierte endringer i tarmbiodiversitet.

Separate sterile prøvetakingsbeholdere vil bli brukt for avføringsaspiratene og slimhinnebiopsiene fra sigmoid colon, cecum og terminal ileum. High-throughput DNA-sekvensering for mikrobiomanalyse vil bli brukt.

Mikrobiom 16S rRNA-profilering Totalt genomisk DNA i samfunnet vil bli tilberedt fra tarmprøver og 16S rRNA-gener PCR amplifisert som tidligere beskrevet. Sammenkoblet, multiplekset sekvensering vil bli utført. 10-20 millioner DNA-sekvenser vil bli generert i en enkelt kjøring og 100 000 rRNA-avlesninger generert per prøve for å sikre >99 % sekvensdekning. Demultipleksing, kvalitetsfiltrering, kimær-fjerning og sekvensklassifisering (ved bruk av SINA/Silva) vil følge tidligere publikasjoner. Lignende sekvenser er gruppert i operasjonelle taksonomiske enheter (OTUs) basert på taksonomi.

Mikrobiomdataanalyse Hovedresultatet er prosent relativ overflod (PRA) av mikrobielle grupper, og vi antar at dette vil variere mellom PPI-brukere og ikke-brukere av syredempende medisiner. Spesifikke mikrobielle grupper (arter/slekter/fyla) som er forskjellige mellom eksperimentelle grupper vil bli identifisert ved hjelp av en ikke-parametrisk todelt statistikk.40 Statistiske analyser vil bli vurdert til = 0,05 og p-verdier korrigert for falsk oppdagelsesrate (FDR).41 Resultatene vil bli validert av artsspesifikk QPCR.

Mål 2: Å bestemme om PPI-bruk endrer den relative mengden av tarmbakterie-RNA dedikert til fermenteringssyklusen hos individer i NW og OB. Vi vil utføre haglesekvensering av bulk-RNA fremstilt fra intestinale mikrobiomer for å identifisere mikrobielle metabolske veier differensielt uttrykt hos pasienter på PPI. Avføringsaspirater fra terminal ileum, blindtarm og sigmoid colon vil bli oppnådd som beskrevet ovenfor.

RNA-isolering og sekvensering Mikrobiell RNA vil bli ekstrahert fra 50 mg fecal aspirater ved å bruke RiboPure Bacteria-ekstraksjonssettet (Life Technologies Inc., USA). For denne piloten vil vi analysere prøver fra totalt 48 forsøkspersoner fordelt likt mellom fire grupper: OB/PPI, OB/ikke-PPI, NW/PPI og NW/ikke-PPI. Verts- og mikrobiell rRNA vil bli fjernet ved hjelp av Ribo-Zero-bakterier og Ribo-Zero-musesett (Epicentre, Inc, USA). RNA-prøver vil bli klargjort for sekvensering ved å bruke ScriptSeq v2 RNA-Seq (bakterier)-sett (Epicentre, Inc, USA). Sekvensering vil bli utført på en Illumina HiSeq2000-plattform (UC-Denver Microarray og Genomics Core), som gir høy dekningsdybde. For kvalitetssikring av reproduserbarhet vil to mRNA-prøver av hver prøve bli slått sammen og sekvensert. I dette piloteksperimentet vil vi generere ~20x106 single-end 150-base avlesninger per prøve for hvert mikrobielt meta-transkriptom-datasett.

Metatranskriptomdataanalyse Annotering og opptelling av bakterielle transkripter vil bli utført på peptidnivå ved bruk av BLASTX-søk mot de omtrent 1800 bakterielle genomsekvensene som for tiden er tilgjengelige i GenBank, samt NCBIs ikke-redundante proteindatabase ved bruk av en E-verdi cutoff på <10- 5,44 Bredt nivå funksjonelle forskjeller mellom prøvene vil bli vurdert ved hjelp av merknader generert gjennom COG,47 KEGG48 og RAST/SEED-verktøyene.49, 50 Statistisk analyse av enteriske mikrobielle transkriptomer vil fokusere på identifisering av metabolske veier som er differensielt uttrykt mellom grupper.44 Gener med merknader av høy kvalitet (E<10-5) vil bli brukt til å konstruere en NxM-matrise av gener (M) ved at forsøkspersoner (N) registrerer antall sekvenslesninger som er kommentert for et gitt gen og subjekt. En lignende NxM-matrise av genkategorier (M) av subjekter (N) vil bli konstruert for å tabulere fordelingen av sekvensavlesninger tilordnet funksjonelle kategorier. Gener eller genkategorier som avviker i prevalens eller forekomst mellom behandlingsgrupper vil bli identifisert av henholdsvis Fisher eksakte test eller Kruskal-Wallis test, brukt på hvert gen/kategori i matrisen. Signifikans vil bli vurdert til = 0,05, etter korreksjon for FDR.41 vil P-verdier bli brukt til å prioritere en kandidatgenliste for oppfølgingsvalidering ved bruk av QPCR for å screene for genuttrykk på tvers av hele pasientkohorten.

Mål 3: Å bestemme i hvilken grad PPI-bruk endrer ekspresjonen av GPR41, GPR43 og deres effektorgener i tykktarmen og terminal ileum hos NW- og OB-pasienter. Biopsiprøver vil bli utsatt for et panel med RT-QPCR-analyser for å overvåke ekspresjon av målgener påvirket av mikrobiell SCFA-produksjon. Biopsier fra terminal ileum, cecum og sigmoid colon vil bli tatt som beskrevet ovenfor.

Kvantitativ revers transkriptase-PCR (qRT-PCR) analyse Totalt RNA vil bli ekstrahert ved å bruke RNeasy Mini Kit (Qiagen) og ISOGEN (WAKO). Komplementære DNA-er vil bli transkribert ved bruk av RNA-er som maler med Moloney murine leukemivirus revers transkriptase (Invitrogen). cDNA-er vil bli amplifisert ved PCR med Taq DNA-polymerase (TaKaRa) ved bruk av passende primere. qRT-PCR-analyser vil bli utført ved bruk av DNA Engine Opticon-2 (MJ Research). Uttrykket vil kvantifiseres i duplikat.

Prøvestørrelse og effektanalyse:

Vi vil melde inn 24 NW og 24 obese (OB) deltakere. Halvparten av NW- og OB-gruppene vil være PPI-brukere og halvparten vil være ikke-brukere av syredempende medisiner. Det primære resultatet for mål 1 er forskjellen i PRA for Firmicutes og Bacteroidetes. En toveis ANOVA (faktorer av BMI-kategori og PPI-bruk) vil bli brukt. Basert på våre foreløpige data vil vi ha 94 % kraft til å oppdage en forskjell i PRA av Firmicutes (72 % vs 52 % med SD på 20 %) og 95 % kraft til å oppdage forskjeller i PRA av Bacteroidetes (16 % vs 5 % med SD på 5 %) mellom PPI-brukere og ikke-brukere. Det primære resultatet for mål 2 er forskjellen i bakteriell RNA dedikert til fermenteringssyklusen, mens utfallet for mål 3 er forskjellen i uttrykk for GPR 41 og GPR 43. Basert på de forventede forskjellene i tarmmikrobiotaprofilen og påfølgende SCFA-produksjon, forventer vi en forskjell på 25 % mellom PPI-brukere og ikke-brukere for begge utfallene, noe som gir oss 99 % kraft for både mål 2 og 3). Vi vil også utføre undergruppeanalyser innenfor NW- og OB-gruppene.