L'effetto della terapia con PPI su peso, microbioma intestinale ed espressione di GPR41 e GPR43

Piano di ricerca:

I pazienti senza sintomi gastrointestinali programmati per uno screening o una colonscopia di sorveglianza (per cancro del colon-retto) presso il laboratorio di endoscopia UCH verranno selezionati per lo studio in base ai criteri di inclusione ed esclusione. I pazienti idonei che acconsentono allo studio avranno altezza, peso e informazioni demografiche misurate e registrate. Completeranno un questionario sull'anamnesi peso/dieta. I pazienti saranno sottoposti alla colonscopia di screening/sorveglianza per cure cliniche di routine. Le feci residue vengono aspirate standard attraverso il colonscopio per garantire la visualizzazione completa della mucosa per migliorare il rilevamento del polipo. Preleveremo aspirati fecali da tre posizioni separate: colon sigmoideo, cieco e ileo terminale. L'evidenza suggerisce che una preparazione intestinale (precedente alla colonscopia) non modifica in modo significativo la composizione del microbiota intestinale per la maggior parte dei soggetti. Prenderemo anche quattro piccole biopsie pizzicate in ciascuno di questi tre siti. Gli aspirati fecali ei campioni bioptici saranno congelati in N2 liquido e congelati a -80°C fino al momento del loro dosaggio.

Arruolaremo un totale di 48 soggetti divisi equamente tra quattro gruppi: OB/PPI, OB/non-PPI, NW/PPI e NW/non-PPI. Circa 40-50 pazienti a settimana che soddisfano i criteri di inclusione/esclusione di cui sopra vengono sottoposti a una colonscopia di screening/sorveglianza presso UCH, rendendo realistico il reclutamento di 2-3 pazienti/settimana nell'arco di 6-9 mesi per raggiungere l'arruolamento mirato.

Obiettivo 1: esaminare gli effetti dell'uso di PPI sul microbiota intestinale nel colon e nell'ileo terminale di pazienti normopeso (NW) e obesi (OB). I microbiomi intestinali saranno profilati mediante sequenziamento dell'rRNA 16S per identificare alterazioni associate a PPI nella biodiversità intestinale.

Verranno utilizzati contenitori per la raccolta dei campioni sterili separati per gli aspirati fecali e le biopsie della mucosa del colon sigmoideo, del cieco e dell'ileo terminale. Verrà utilizzato il sequenziamento del DNA ad alto rendimento per l'analisi del microbioma.

Microbioma 16S rRNA Profiling Il DNA genomico totale della comunità sarà preparato da campioni intestinali e geni 16S rRNA PCR amplificati come precedentemente descritto. Verrà eseguito il sequenziamento multiplexed paired-end. Verranno generate 10-20 milioni di sequenze di DNA in una singola corsa e 100.000 letture di rRNA generate per campione per garantire una copertura della sequenza >99%. Il demultiplexing, il filtraggio della qualità, la rimozione delle chimere e la classificazione delle sequenze (utilizzando SINA/Silva) seguiranno le precedenti pubblicazioni. Sequenze simili sono raggruppate in unità tassonomiche operative (OTU) basate sulla tassonomia.

Analisi dei dati del microbioma Il risultato principale è la percentuale di abbondanza relativa (PRA) dei gruppi microbici e ipotizziamo che questo differirà tra gli utilizzatori di PPI e i non utilizzatori di farmaci per la soppressione dell'acido. Gruppi microbici specifici (specie/generi/phyla) che differiscono tra i gruppi sperimentali saranno identificati utilizzando una statistica in due parti non parametrica.40 Le analisi statistiche saranno valutate a = 0,05 e p-value corretti per il tasso di false scoperte (FDR).41 I risultati saranno validati mediante QPCR specie-specifica.

Obiettivo 2: Determinare se l'uso di PPI altera la quantità relativa di RNA batterico intestinale dedicato al ciclo di fermentazione negli individui NW e OB. Eseguiremo il sequenziamento shotgun dell'RNA di massa preparato dai microbiomi intestinali per identificare le vie metaboliche microbiche espresse in modo differenziato nei pazienti trattati con PPI. Gli aspirati fecali dall'ileo terminale, dal cieco e dal colon sigmoideo saranno ottenuti come descritto sopra.

Isolamento e sequenziamento dell'RNA L'RNA microbico sarà estratto da 50 mg di aspirati fecali utilizzando il kit di estrazione RiboPure Bacteria (Life Technologies Inc., USA). Per questo pilota, analizzeremo i campioni di un totale di 48 soggetti divisi equamente in quattro gruppi: OB/PPI, OB/non-PPI, NW/PPI e NW/non-PPI. L'rRNA ospite e microbico sarà rimosso utilizzando i kit di batteri Ribo-Zero e topi Ribo-Zero (Epicentre, Inc, USA). I campioni di RNA saranno preparati per il sequenziamento utilizzando i kit ScriptSeq v2 RNA-Seq (batteri) (Epicentre, Inc, USA). Il sequenziamento sarà eseguito su una piattaforma Illumina HiSeq2000 (UC-Denver Microarray e Genomics Core), che fornisce un'elevata profondità di copertura. Per garantire la qualità della riproducibilità, due campioni di mRNA di ciascun campione saranno raggruppati e sequenziati. In questo esperimento pilota, genereremo ~ 20x106 letture di 150 basi single-end per campione per ogni set di dati di meta-trascrittoma microbico.

Analisi dei dati del metatrascrittoma L'annotazione e l'enumerazione dei trascritti batterici sarà eseguita a livello di peptide utilizzando ricerche BLASTX rispetto alle circa 1800 sequenze di genoma batterico attualmente disponibili in GenBank e nel database delle proteine ​​​​non ridondanti dell'NCBI utilizzando un limite di valore E di <10- 5.44 Le differenze funzionali di ampio livello tra i campioni saranno valutate utilizzando annotazioni generate tramite gli strumenti COG,47 KEGG48 e RAST/SEED.49, 50 L'analisi statistica dei trascrittomi microbici enterici si concentrerà sull'identificazione delle vie metaboliche che sono espresse in modo differenziato tra i gruppi.44 I geni con annotazioni di alta qualità (E<10-5) saranno usati per costruire una matrice NxM di geni (M) per soggetti (N) registrando il numero di letture di sequenze annotate per un dato gene e soggetto. Una simile matrice NxM di categorie geniche (M) per soggetti (N) sarà costruita per tabulare la distribuzione delle letture di sequenze assegnate alle categorie funzionali. I geni o le categorie di geni che differiscono in prevalenza o abbondanza tra i gruppi di trattamento saranno identificati mediante il test esatto di Fisher o il test di Kruskal-Wallis, rispettivamente, applicati a ciascun gene/categoria nella matrice. La significatività sarà valutata a = 0,05, dopo la correzione per FDR.41 I valori P saranno utilizzati per dare la priorità a un elenco di geni candidati per la convalida del follow-up utilizzando QPCR per lo screening dell'espressione genica nell'intera coorte di pazienti.

Obiettivo 3: Determinare la misura in cui l'uso di PPI altera l'espressione di GPR41, GPR43 e dei loro geni effettori nel colon e nell'ileo terminale di pazienti NW e OB. I campioni bioptici saranno sottoposti a un pannello di test RT-QPCR per monitorare l'espressione dei geni bersaglio influenzati dalla produzione microbica di SCFA. Le biopsie dell'ileo terminale, del cieco e del colon sigmoideo saranno ottenute come descritto sopra.

Analisi quantitativa della trascrittasi inversa-PCR (qRT-PCR) L'RNA totale sarà estratto utilizzando RNeasy Mini Kit (Qiagen) e ISOGEN (WAKO). I DNA complementari saranno trascritti utilizzando RNA come template con la trascrittasi inversa del virus della leucemia murina Moloney (Invitrogen). I cDNA saranno amplificati mediante PCR con Taq DNA polimerasi (TaKaRa) utilizzando i primer appropriati. Le analisi qRT-PCR saranno eseguite utilizzando DNA Engine Opticon-2 (MJ Research). L'espressione sarà quantificata in duplicato.

Dimensione del campione e analisi della potenza:

Arruolaremo 24 partecipanti NW e 24 obesi (OB). La metà dei gruppi NW e OB saranno utilizzatori di PPI e metà saranno non utilizzatori di farmaci antiacidi. L'esito primario per l'obiettivo 1 è la differenza nel PRA di Firmicutes e Bacteroidetes. Verrà utilizzato un ANOVA a due vie (fattori di categoria BMI e uso di PPI). Sulla base dei nostri dati preliminari, avremo il 94% di potere per rilevare una differenza nel PRA di Firmicutes (72% vs 52% con SD del 20%) e il 95% di potere per rilevare differenze nel PRA di Bacteroidetes (16% vs 5 % con SD del 5%) tra utenti PPI e non utenti. L'esito primario per l'obiettivo 2 è la differenza nell'RNA batterico dedicato al ciclo di fermentazione, mentre l'esito per l'obiettivo 3 è la differenza nell'espressione di GPR 41 e GPR 43. Sulla base delle differenze attese nel profilo del microbiota intestinale e nella successiva produzione di SCFA, ci aspettiamo una differenza del 25% tra utilizzatori e non utilizzatori di PPI per entrambi i risultati, dandoci una potenza del 99% per entrambi gli obiettivi 2 e 3). Effettueremo anche analisi di sottogruppi all'interno dei gruppi NW e OB.