Влияние терапии ИПП на вес, микробиом кишечника и экспрессию GPR41 и GPR43

План исследования:

Пациенты без желудочно-кишечных симптомов, запланированные для скрининговой или контрольной колоноскопии (на предмет колоректального рака) в эндоскопической лаборатории UCH, будут отобраны для участия в исследовании на основе критериев включения и исключения. У подходящих пациентов, которые дали согласие на участие в исследовании, будет измерена и записана информация о росте, весе и демографических данных. Они заполнят анкету истории веса/диеты. Пациенты будут проходить скрининговую/наблюдательную колоноскопию в соответствии с обычной клинической практикой. Остаточный стул обычно аспирируется через колоноскоп, чтобы обеспечить полную визуализацию слизистой оболочки и улучшить обнаружение полипов. Мы возьмем аспираты стула из трех отдельных мест: сигмовидной кишки, слепой кишки и терминального отдела подвздошной кишки. Имеющиеся данные свидетельствуют о том, что подготовка кишечника (перед колоноскопией) существенно не меняет состав микробиоты кишечника у большинства субъектов. Мы также возьмем четыре небольших щипковых биопсии в каждом из этих трех мест. Аспираты стула и образцы биопсии будут быстро заморожены в жидком N2 и заморожены при температуре -80°C до тех пор, пока они не потребуются для их анализов.

Мы будем регистрировать в общей сложности 48 субъектов, разделенных поровну на четыре группы: OB/PPI, OB/non-PPI, NW/PPI и NW/non-PPI. Приблизительно 40–50 пациентов в неделю, отвечающих вышеуказанным критериям включения/исключения, проходят скрининговую/наблюдательную колоноскопию в UCH, что делает реалистичным набор 2–3 пациентов в неделю в течение 6–9 месяцев для достижения целевого набора.

Цель 1: изучить влияние использования ИПП на микробиоту кишечника в толстой кишке и терминальном отделе подвздошной кишки у пациентов с нормальным весом (NW) и ожирением (OB). Кишечные микробиомы будут профилированы с помощью секвенирования 16S рРНК для выявления связанных с ИПП изменений в биоразнообразии кишечника.

Отдельные стерильные контейнеры для сбора образцов будут использоваться для аспиратов стула и биопсии слизистой оболочки из сигмовидной кишки, слепой кишки и терминального отдела подвздошной кишки. Будет использоваться высокопроизводительное секвенирование ДНК для анализа микробиома.

Профилирование 16S рРНК микробиома Полная геномная ДНК сообщества будет получена из образцов кишечника, а гены 16S рРНК амплифицированы методом ПЦР, как описано ранее. Будет выполнено парное мультиплексное секвенирование. 10–20 миллионов последовательностей ДНК будут сгенерированы за один прогон и 100 000 считываний рРНК на образец, чтобы обеспечить покрытие последовательностей > 99%. Демультиплексирование, качественная фильтрация, удаление химер и классификация последовательностей (с использованием SINA/Silva) будут следовать предыдущим публикациям. Подобные последовательности группируются в операционные таксономические единицы (OTU) на основе таксономии.

Анализ данных микробиома Основным результатом является процент относительной численности (PRA) микробных групп, и мы предполагаем, что он будет различаться между пользователями ИПП и теми, кто не использует препараты, подавляющие кислотность. Конкретные микробные группы (виды/роды/типы), которые различаются между экспериментальными группами, будут идентифицированы с использованием непараметрической статистики из двух частей.40 Статистический анализ будет оцениваться как = 0,05, а значения p будут скорректированы на коэффициент ложных открытий (FDR)41. Результаты будут подтверждены видоспецифичной количественной ПЦР.

Цель 2: определить, изменяет ли использование ИПП относительное количество кишечной бактериальной РНК, связанной с циклом ферментации у людей с НЗ и ОБ. Мы проведем дробовое секвенирование объемной РНК, полученной из кишечных микробиомов, чтобы идентифицировать микробные метаболические пути, дифференциально выраженные у пациентов, принимающих ИПП. Аспираты стула из терминального отдела подвздошной, слепой и сигмовидной кишки будут получены, как описано выше.

Выделение и секвенирование РНК Микробную РНК экстрагируют из 50 мг фекальных аспиратов с использованием набора для экстракции RiboPure Bacteria (Life Technologies Inc., США). Для этого пилотного проекта мы проанализируем образцы от 48 субъектов, разделенных поровну на четыре группы: OB/PPI, OB/без PPI, NW/PPI и NW/без PPI. Хозяин и микробная рРНК будут удалены с использованием набора бактерий Ribo-Zero и мышей Ribo-Zero (Epicentre, Inc, США). Образцы РНК будут подготовлены для секвенирования с использованием наборов ScriptSeq v2 RNA-Seq (бактерии) (Epicentre, Inc, США). Секвенирование будет проводиться на платформе Illumina HiSeq2000 (UC-Denver Microarray и Genomics Core), которая обеспечивает большую глубину охвата. Для обеспечения качества воспроизводимости два образца мРНК каждого образца будут объединены и секвенированы. В этом пилотном эксперименте мы будем генерировать ~ 20x106 односторонних считываний по 150 оснований на образец для каждого набора данных микробного мета-транскриптома.

Анализ метатранскриптомных данных Аннотирование и подсчет бактериальных транскриптов будет выполняться на уровне пептидов с использованием поиска BLASTX по приблизительно 1800 последовательностям бактериального генома, доступным в настоящее время в GenBank, а также в базе данных неизбыточных белков NCBI с использованием порогового значения Е-значения <10- 5,44 Общие функциональные различия между образцами будут оцениваться с использованием аннотаций, созданных с помощью инструментов COG47, KEGG48 и RAST/SEED49. 50 Статистический анализ кишечных микробных транскриптомов будет сосредоточен на идентификации метаболических путей, которые по-разному экспрессируются между группами.44 Гены с аннотациями высокого качества (E<10-5) будут использоваться для построения NxM матрицы генов (M) субъектами (N), регистрируя количество прочтений последовательности, аннотированных для данного гена и субъекта. Аналогичная матрица NxM категорий генов (M) по субъектам (N) будет построена для табулирования распределения прочтений последовательностей, отнесенных к функциональным категориям. Гены или категории генов, которые различаются по распространенности или распространенности между группами лечения, будут идентифицированы с помощью точного теста Фишера или теста Крускала-Уоллиса, соответственно, применяемых к каждому гену/категории в матрице. Значимость будет оцениваться при = 0,05, после поправки на FDR.41 P-значения будут использоваться для определения приоритетности списка генов-кандидатов для последующей проверки с использованием QPCR для скрининга экспрессии генов во всей когорте пациентов.

Цель 3: определить, в какой степени использование ИПП изменяет экспрессию GPR41, GPR43 и их эффекторных генов в толстой кишке и терминальном отделе подвздошной кишки у пациентов с NW и OB. Образцы биопсии будут подвергаться анализу RT-QPCR для мониторинга экспрессии генов-мишеней, на которые влияет продукция микробных SCFAs. Биоптаты из терминального отдела подвздошной, слепой и сигмовидной кишки будут получены, как описано выше.

Количественный анализ обратной транскриптазы-ПЦР (qRT-PCR) Общая РНК будет извлечена с использованием набора RNeasy Mini Kit (Qiagen) и ISOGEN (WAKO). Комплементарные ДНК будут транскрибированы с использованием РНК в качестве матриц с обратной транскриптазой вируса мышиного лейкоза Молони (Invitrogen). кДНК будут амплифицировать с помощью ПЦР с ДНК-полимеразой Taq (TaKaRa) с использованием соответствующих праймеров. Анализы qRT-PCR будут выполняться с использованием DNA Engine Opticon-2 (MJ Research). Выражение будет количественно определено в двух экземплярах.

Размер выборки и анализ мощности:

Мы зачислим 24 участника NW и 24 участника с ожирением (OB). Половина групп NW и OB будут принимать ИПП, а половина не будет принимать препараты, подавляющие кислотность. Основным результатом для цели 1 является разница в PRA Firmicutes и Bacteroidetes. Будет использоваться двусторонний дисперсионный анализ (факторы категории ИМТ и использование ИЦП). Основываясь на наших предварительных данных, мы будем иметь мощность 94% для обнаружения различий в PRA Firmicutes (72% против 52% при стандартном отклонении 20%) и мощность 95% для обнаружения различий в PRA Bacteroidetes (16% против 5). % с SD 5%) между пользователями PPI и непользователями. Основным результатом для цели 2 является разница в бактериальной РНК, связанной с циклом ферментации, в то время как результатом для цели 3 является разница в экспрессии GPR 41 и GPR 43. Основываясь на ожидаемых различиях в профиле кишечной микробиоты и последующем производстве SCFAs, мы ожидаем 25-процентную разницу между пользователями ИПП и не-пользователями для обоих результатов, что дает нам мощность 99% для целей 2 и 3). Мы также проведем анализ подгрупп внутри групп NW и OB.