L'effet de la thérapie IPP sur le poids, le microbiome intestinal et l'expression de GPR41 et GPR43

Plan de recherche:

Les patients sans symptômes gastro-intestinaux devant subir une coloscopie de dépistage ou de surveillance (pour le cancer colorectal) au laboratoire d'endoscopie de l'UCH seront sélectionnés pour l'étude sur la base des critères d'inclusion et d'exclusion. Les patients éligibles qui consentent à l'étude verront leur taille, leur poids et leurs informations démographiques mesurés et enregistrés. Ils rempliront un questionnaire sur l'historique du poids et de l'alimentation. Les patients subiront la coloscopie de dépistage/surveillance selon les soins cliniques de routine. Les selles résiduelles sont normalement aspirées à travers le coloscope pour assurer une visualisation complète de la muqueuse afin d'améliorer la détection des polypes. Nous effectuerons des prélèvements de selles à trois endroits distincts : le côlon sigmoïde, le caecum et l'iléon terminal. Les preuves suggèrent qu'une préparation intestinale (avant la coloscopie) ne modifie pas de manière significative la composition du microbiote intestinal pour la majorité des sujets. Nous effectuerons également quatre petites biopsies par pincement à chacun de ces trois sites. Les prélèvements de selles et les échantillons de biopsie seront congelés instantanément dans du N2 liquide et congelés à -80 °C jusqu'à ce qu'ils soient requis pour leurs analyses.

Nous inscrirons un total de 48 sujets répartis également entre quatre groupes : OB/PPI, OB/non-PPI, NW/PPI et NW/non-PPI. Environ 40 à 50 patients par semaine répondant aux critères d'inclusion/exclusion ci-dessus subissent une coloscopie de dépistage/surveillance à l'UCH, ce qui rend le recrutement de 2 à 3 patients/semaine sur 6 à 9 mois réaliste pour atteindre l'objectif d'inscription.

Objectif 1 : Examiner les effets de l'utilisation des IPP sur le microbiote intestinal dans le côlon et l'iléon terminal des patients de poids normal (NW) et obèses (OB). Les microbiomes intestinaux seront profilés par séquençage de l'ARNr 16S pour identifier les altérations associées aux IPP dans la biodiversité intestinale.

Des conteneurs de collecte d'échantillons stériles séparés seront utilisés pour les aspirations de selles et les biopsies muqueuses du côlon sigmoïde, du caecum et de l'iléon terminal. Le séquençage d'ADN à haut débit pour l'analyse du microbiome sera utilisé.

Profilage de l'ARNr 16S du microbiome L'ADN génomique communautaire total sera préparé à partir d'échantillons intestinaux et les gènes d'ARNr 16S seront amplifiés par PCR comme décrit précédemment. Un séquençage multiplexé apparié sera effectué. 10 à 20 millions de séquences d'ADN seront générées en une seule analyse et 100 000 lectures d'ARNr générées par échantillon pour garantir une couverture de séquence > 99 %. Le démultiplexage, le filtrage de qualité, l'élimination des chimères et la classification des séquences (à l'aide de SINA/Silva) suivront les publications précédentes. Des séquences similaires sont regroupées en unités taxonomiques opérationnelles (OTU) basées sur la taxonomie.

Analyse des données sur le microbiome Le principal résultat est le pourcentage d'abondance relative (ARP) des groupes microbiens, et nous émettons l'hypothèse que cela différera entre les utilisateurs d'IPP et les non-utilisateurs de médicaments anti-acide. Les groupes microbiens spécifiques (espèces/genres/embranchements) qui diffèrent entre les groupes expérimentaux seront identifiés à l'aide d'une statistique non paramétrique en deux parties.40 Les analyses statistiques seront évaluées à = 0,05 et les valeurs de p corrigées du taux de fausses découvertes (FDR).41 Les résultats seront validés par des QPCR spécifiques à l'espèce.

Objectif 2 : Déterminer si l'utilisation d'IPP modifie la quantité relative d'ARN bactérien intestinal dédié au cycle de fermentation chez les individus NW et OB. Nous effectuerons un séquençage en fusil de chasse d'ARN en vrac préparé à partir de microbiomes intestinaux pour identifier les voies métaboliques microbiennes exprimées de manière différentielle chez les patients sous IPP. Les aspirations de selles de l'iléon terminal, du caecum et du côlon sigmoïde seront obtenues comme indiqué ci-dessus.

Isolement et séquençage de l'ARN L'ARN microbien sera extrait de 50 mg d'aspirations fécales à l'aide du kit d'extraction RiboPure Bacteria (Life Technologies Inc., USA). Pour ce pilote, nous analyserons des échantillons d'un total de 48 sujets répartis également entre quatre groupes : OB/PPI, OB/non-PPI, NW/PPI et NW/non-PPI. L'ARNr hôte et microbien sera éliminé à l'aide des kits de bactéries Ribo-Zero et de souris Ribo-Zero (Epicentre, Inc, USA). Les échantillons d'ARN seront préparés pour le séquençage à l'aide des kits ScriptSeq v2 RNA-Seq (bactéries) (Epicentre, Inc, USA). Le séquençage sera effectué sur une plate-forme Illumina HiSeq2000 (UC-Denver Microarray and Genomics Core), qui offre une grande profondeur de couverture. Pour garantir la qualité de la reproductibilité, deux échantillons d'ARNm de chaque échantillon seront regroupés et séquencés. Dans cette expérience pilote, nous générerons ~ 20x106 lectures de 150 bases à extrémité unique par échantillon pour chaque ensemble de données de méta-transcriptome microbien.

Analyse des données du métatranscriptome L'annotation et l'énumération des transcrits bactériens seront effectuées au niveau des peptides à l'aide de recherches BLASTX sur les quelque 1800 séquences de génomes bactériens actuellement disponibles dans GenBank ainsi que sur la base de données de protéines non redondantes du NCBI en utilisant un seuil de valeur E de <10- 5.44 Les différences fonctionnelles générales entre les échantillons seront évaluées à l'aide d'annotations générées par les outils COG,47 KEGG48 et RAST/SEED.49, 50 L'analyse statistique des transcriptomes microbiens entériques se concentrera sur l'identification des voies métaboliques qui sont exprimées différemment entre les groupes.44 Les gènes avec des annotations de haute qualité (E<10-5) seront utilisés pour construire une matrice NxM de gènes (M) par des sujets (N) enregistrant le nombre de séquences lues annotées pour un gène et un sujet donnés. Une matrice NxM similaire de catégories de gènes (M) par sujets (N) sera construite pour tabuler la distribution des lectures de séquences attribuées aux catégories fonctionnelles. Les gènes ou les catégories de gènes qui diffèrent en prévalence ou en abondance entre les groupes de traitement seront identifiés par le test exact de Fisher ou le test de Kruskal-Wallis, respectivement, appliqués à chaque gène/catégorie dans la matrice. La signification sera évaluée à = 0,05, après correction pour FDR.41 Les valeurs P seront utilisées pour hiérarchiser une liste de gènes candidats pour une validation de suivi à l'aide de QPCR pour dépister l'expression des gènes dans l'ensemble de la cohorte de patients.

Objectif 3 : Déterminer dans quelle mesure l'utilisation des IPP modifie l'expression de GPR41, GPR43 et de leurs gènes effecteurs dans le côlon et l'iléon terminal des patients NW et OB. Les échantillons de biopsie seront soumis à un panel de tests RT-QPCR pour surveiller l'expression des gènes cibles impactés par la production microbienne d'AGCC. Des biopsies de l'iléon terminal, du caecum et du côlon sigmoïde seront obtenues comme indiqué ci-dessus.

Analyse quantitative de la transcriptase inverse-PCR (qRT-PCR) L'ARN total sera extrait à l'aide du kit RNeasy Mini (Qiagen) et ISOGEN (WAKO). Les ADN complémentaires seront transcrits en utilisant des ARN comme matrices avec la transcriptase inverse du virus de la leucémie murine de Moloney (Invitrogen). Les ADNc seront amplifiés par PCR avec la Taq ADN polymérase (TaKaRa) en utilisant les amorces appropriées. Les analyses qRT-PCR seront effectuées à l'aide de DNA Engine Opticon-2 (MJ Research). L'expression sera quantifiée en double.

Taille de l'échantillon et analyse de puissance :

Nous inscrirons 24 participants NW et 24 participants obèses (OB). La moitié des groupes NW et OB seront des utilisateurs d'IPP et l'autre moitié ne seront pas des utilisateurs de médicaments antiacides. Le résultat principal pour l'objectif 1 est la différence dans l'ARP des Firmicutes et des Bacteroidetes. Une ANOVA à deux facteurs (facteurs de catégorie d'IMC et d'utilisation d'IPP) sera utilisée. Sur la base de nos données préliminaires, nous aurons une puissance de 94 % pour détecter une différence dans le PRA des Firmicutes (72 % contre 52 % avec un SD de 20 %) et une puissance de 95 % pour détecter des différences dans le PRA des Bacteroidetes (16 % contre 5 % avec SD de 5 %) entre les utilisateurs de PPI et les non-utilisateurs. Le résultat principal pour l'objectif 2 est la différence d'ARN bactérien dédié au cycle de fermentation, tandis que le résultat pour l'objectif 3 est la différence d'expression de GPR 41 et GPR 43. Sur la base des différences attendues dans le profil du microbiote intestinal et la production subséquente d'AGCC, nous prévoyons une différence de 25 % entre les utilisateurs d'IPP et les non-utilisateurs pour les deux résultats, ce qui nous donne une puissance de 99 % pour les objectifs 2 et 3). Nous effectuerons également des analyses de sous-groupes au sein des groupes NW et OB.