Het effect van PPI-therapie op gewicht, darmmicrobioom en expressie van GPR41 en GPR43

Onderzoeksplan:

Patiënten zonder gastro-intestinale symptomen die zijn ingepland voor een screening of surveillance colonoscopie (voor colorectale kanker) in het UCH-endoscopielaboratorium, worden voor de studie gescreend op basis van de in- en exclusiecriteria. In aanmerking komende patiënten die instemmen met het onderzoek zullen lengte, gewicht en demografische informatie laten meten en vastleggen. Ze zullen een vragenlijst over gewicht / dieetgeschiedenis invullen. Patiënten ondergaan de screening/surveillance colonoscopie per routinematige klinische zorg. Overgebleven ontlasting wordt standaard via de colonoscoop opgezogen om een ​​volledige visualisatie van het slijmvlies te garanderen en de detectie van poliepen te verbeteren. We nemen ontlastingsafscheidingen van drie afzonderlijke locaties: sigmoïde colon, blindedarm en terminale ileum. Er zijn aanwijzingen dat een darmvoorbereiding (vóór colonoscopie) de samenstelling van de darmmicrobiota voor de meeste proefpersonen niet significant verandert. We zullen ook vier kleine, knijpbiopten nemen op elk van deze drie locaties. Ontlastingsaspiraten en biopsiespecimens worden snel ingevroren in vloeibare N2 en ingevroren bij -80°C totdat ze nodig zijn voor hun assays.

We zullen in totaal 48 proefpersonen inschrijven, gelijkelijk verdeeld over vier groepen: OB/PPI, OB/niet-PPI, NW/PPI en NW/niet-PPI. Ongeveer 40-50 patiënten per week die aan de bovenstaande inclusie-/exclusiecriteria voldoen, ondergaan een screening/surveillancecolonoscopie bij UCH, waardoor rekrutering van 2-3 patiënten/week gedurende 6-9 maanden realistisch is om de beoogde inschrijving te bereiken.

Doel 1: Het onderzoeken van de effecten van PPI-gebruik op de darmmicrobiota in de dikke darm en het terminale ileum van patiënten met een normaal gewicht (NW) en obesitas (OB). Intestinale microbiomen zullen worden geprofileerd door 16S rRNA-sequencing om PPI-geassocieerde veranderingen in de darmbiodiversiteit te identificeren.

Afzonderlijke steriele monsterverzamelcontainers zullen worden gebruikt voor de ontlastingaspiraten en mucosale biopsieën van het sigmoïd colon, blindedarm en terminale ileum. High-throughput DNA-sequencing voor microbioomanalyse zal worden gebruikt.

Microbioom 16S rRNA-profilering Totaal gemeenschapsgenomisch DNA zal worden bereid uit darmspecimens en 16S rRNA-genen zullen PCR worden geamplificeerd zoals eerder beschreven. Gepaarde, gemultiplexte sequencing zal worden uitgevoerd. Er zullen 10-20 miljoen DNA-sequenties worden gegenereerd in een enkele run en 100.000 rRNA-reads per monster om een ​​sequentiedekking van >99% te garanderen. Demultiplexing, kwaliteitsfiltering, chimera-verwijdering en sequentieclassificatie (met behulp van SINA/Silva) volgen op eerdere publicaties. Vergelijkbare reeksen zijn gegroepeerd in operationele taxonomische eenheden (OTU's) op basis van taxonomie.

Analyse van microbioomgegevens Het belangrijkste resultaat is het percentage relatieve abundantie (PRA) van microbiële groepen, en we veronderstellen dat dit zal verschillen tussen PPI-gebruikers en niet-gebruikers van zuuronderdrukkende medicijnen. Specifieke microbiële groepen (soorten/geslachten/phyla) die verschillen tussen experimentele groepen zullen worden geïdentificeerd met behulp van een niet-parametrische tweedelige statistiek.40 Statistische analyses worden beoordeeld op = 0,05 en p-waarden worden gecorrigeerd voor false discovery rate (FDR).41 Resultaten zullen worden gevalideerd door soortspecifieke QPCR.

Doel 2: Bepalen of het gebruik van PPI's de relatieve hoeveelheid bacterieel RNA in de darmen, bestemd voor de fermentatiecyclus, verandert bij NW- en OB-individuen. We zullen shotgun-sequencing uitvoeren van bulk-RNA bereid uit intestinale microbiomen om microbiële metabolische routes te identificeren die differentieel tot expressie worden gebracht bij patiënten op PPI's. Ontlasting aspiraat van het terminale ileum, caecum en sigmoid colon zal worden verkregen zoals hierboven beschreven.

RNA-isolatie en sequentiebepaling Microbieel RNA zal worden geëxtraheerd uit 50 mg fecale aspiraten met behulp van de RiboPure Bacteria-extractiekit (Life Technologies Inc., VS). Voor deze pilot testen we monsters van in totaal 48 proefpersonen, gelijkelijk verdeeld over vier groepen: OB/PPI, OB/niet-PPI, NW/PPI en NW/niet-PPI. Gastheer en microbieel rRNA zullen worden verwijderd met behulp van de Ribo-Zero-bacteriën en Ribo-Zero-muizenkits (Epicentre, Inc, VS). RNA-monsters zullen worden voorbereid voor sequentiebepaling met behulp van de ScriptSeq v2 RNA-Seq (bacteriën) kits (Epicentre, Inc, VS). Sequencing zal worden uitgevoerd op een Illumina HiSeq2000-platform (UC-Denver Microarray en Genomics Core), dat een hoge dekkingsgraad biedt. Voor kwaliteitsborging van reproduceerbaarheid worden twee mRNA-monsters van elk monster samengevoegd en gesequenced. In dit pilot-experiment zullen we ~20x106 single-end 150-base reads per sample genereren voor elke microbiële meta-transcriptoom dataset.

Metatranscriptome gegevensanalyse Annotatie en opsomming van bacteriële transcripten zal worden uitgevoerd op peptideniveau met behulp van BLASTX-zoekopdrachten tegen de ongeveer 1800 bacteriële genoomsequenties die momenteel beschikbaar zijn in GenBank, evenals de niet-redundante eiwitdatabase van NCBI met behulp van een E-waarde-grenswaarde van <10- 5.44 Functionele verschillen op breed niveau tussen monsters zullen worden beoordeeld met behulp van annotaties die zijn gegenereerd via de tools COG,47 KEGG48 en RAST/SEED.49, 50 Statistische analyse van enterische microbiële transcriptomen zal zich richten op de identificatie van metabole routes die differentieel tot uiting komen tussen groepen.44 Genen met annotaties van hoge kwaliteit (E<10-5) zullen worden gebruikt om een ​​NxM-matrix van genen (M) te construeren door proefpersonen (N) die het aantal geannoteerde sequentielezingen voor een gegeven gen en proefpersoon registreren. Een vergelijkbare NxM-matrix van gencategorieën (M) per proefpersoon (N) zal worden geconstrueerd om de verdeling van sequentielezingen toegewezen aan functionele categorieën in tabelvorm weer te geven. Genen of gencategorieën die verschillen in prevalentie of overvloed tussen behandelingsgroepen zullen worden geïdentificeerd door respectievelijk de Fisher exact-test of de Kruskal-Wallis-test, toegepast op elk gen/categorie in de matrix. De significantie zal worden beoordeeld op = 0,05, na correctie voor FDR.41 zullen P-waarden worden gebruikt om prioriteit te geven aan een kandidaat-genenlijst voor follow-upvalidatie met behulp van QPCR om te screenen op genexpressie in het gehele patiëntencohort.

Doel 3: Bepalen in welke mate PPI-gebruik de expressie van GPR41, GPR43 en hun effectorgenen in de dikke darm en het terminale ileum van NW- en OB-patiënten verandert. Biopsiespecimens zullen worden onderworpen aan een panel van RT-QPCR-assays om de expressie van doelwitgenen die worden beïnvloed door microbiële SCFA-productie te controleren. Biopsieën van het terminale ileum, blindedarm en sigmoïd colon zullen worden verkregen zoals hierboven beschreven.

Kwantitatieve reverse transcriptase-PCR (qRT-PCR) analyse Totaal RNA zal worden geëxtraheerd met behulp van de RNeasy Mini Kit (Qiagen) en ISOGEN (WAKO). Complementaire DNA's zullen worden getranscribeerd met behulp van RNA's als sjablonen met Moloney muriene leukemievirus reverse transcriptase (Invitrogen). cDNA's zullen worden geamplificeerd door PCR met Taq DNA-polymerase (TaKaRa) met behulp van de juiste primers. qRT-PCR-analyses zullen worden uitgevoerd met behulp van DNA Engine Opticon-2 (MJ Research). De uitdrukking wordt in tweevoud gekwantificeerd.

Steekproefgrootte en vermogensanalyse:

We zullen 24 NW en 24 zwaarlijvige (OB) deelnemers inschrijven. De helft van de NW- en OB-groepen zal PPI-gebruikers zijn en de andere helft zal niet-gebruikers zijn van zuuronderdrukkende medicijnen. De primaire uitkomst voor doel 1 is het verschil in de PRA van Firmicutes en Bacteroidetes. Er zal een tweezijdige ANOVA (factoren van BMI-categorie en PPI-gebruik) worden gebruikt. Op basis van onze voorlopige gegevens zullen we 94% vermogen hebben om een ​​verschil in de PRA van Firmicutes te detecteren (72% versus 52% met SD van 20%) en 95% vermogen om verschillen in de PRA van Bacteroidetes te detecteren (16% versus 5 % met SD van 5%) tussen PPI-gebruikers en niet-gebruikers. Het primaire resultaat voor doel 2 is het verschil in bacterieel RNA dat bestemd is voor de fermentatiecyclus, terwijl het resultaat voor doel 3 het verschil is in expressie van GPR 41 en GPR 43. Op basis van de verwachte verschillen in het profiel van de darmmicrobiota en de daaropvolgende SCFA-productie, verwachten we een verschil van 25% tussen PPI-gebruikers en niet-gebruikers voor beide uitkomsten, wat ons 99% power geeft voor zowel doel 2 als 3). Ook binnen de NW- en OB-groepen gaan we subgroepanalyses uitvoeren.