PPI-hoidon vaikutus painoon, suoliston mikrobiomiin ja GPR41:n ja GPR43:n ilmentymiseen

Tutkimussuunnitelma:

Potilaat, joilla ei ole maha-suolikanavan oireita, joille on varattu seulonta- tai seurantakolonoskopia (kolorektaalisyövän varalta) UCH-endoskopialaboratoriossa, seulotaan tutkimukseen mukaanotto- ja poissulkemiskriteerien perusteella. Tutkimukseen suostuvat potilaat mittaavat ja tallentavat pituuden, painon ja väestötiedot. He täyttävät paino/ruokavaliohistorian kyselylomakkeen. Potilaille tehdään seulonta/seurantakolonoskopia rutiininomaisen kliinisen hoidon mukaisesti. Jäljelle jäänyt uloste imetään tavallisesti kolonoskoopin läpi limakalvon täydellisen visualisoinnin varmistamiseksi polyypin havaitsemisen tehostamiseksi. Otamme ulosteen aspiraattoreita kolmesta eri paikasta: sigmoidisesta paksusuolesta, umpisuolesta ja terminaalisesta sykkyräsuolesta. Todisteet viittaavat siihen, että suolen valmistelu (ennen kolonoskopiaa) ei muuta merkittävästi suoliston mikrobiotan koostumusta suurimmalla osalla koehenkilöistä. Otamme myös neljä pientä biopsiaa kustakin näistä kolmesta paikasta. Ulosteen aspiraatit ja biopsianäytteet pikapakastetaan nestemäiseen N2:een ja pakastetaan -80 °C:seen, kunnes niitä tarvitaan määrityksiä varten.

Ilmoittaudumme yhteensä 48 koehenkilöä jaettuna neljään ryhmään: OB/PPI, OB/ei-PPI, NW/PPI ja NW/ei-PPI. Noin 40-50 potilasta viikossa, jotka täyttävät yllä mainitut sisällyttämis-/poissulkemiskriteerit, käyvät läpi seulonta-/seurantakolonoskopian UCH:ssa, joten 2-3 potilaan rekrytointi viikossa 6-9 kuukauden aikana on realistista, jotta tavoiteltu ilmoittautuminen saavutetaan.

Tavoite 1: Tutkia PPI:n käytön vaikutuksia suoliston mikrobiotaan normaalipainoisten (NW) ja liikalihavien (OB) potilaiden paksusuolessa ja terminaalisessa sykkyräsuolessa. Suoliston mikrobiomit profiloidaan 16S rRNA-sekvensoinnilla PPI:hen liittyvien muutosten tunnistamiseksi suoliston biologisessa monimuotoisuudessa.

Erillisiä steriilejä näytteenkeräysastioita käytetään ulosteen aspiraatteihin ja limakalvobiopsioihin sigmoidisesta paksusuolesta, umpisuolesta ja ileumista. Mikrobiomianalyysiin käytetään suuritehoista DNA-sekvensointia.

Mikrobiomin 16S rRNA:n profilointi Koko yhteisön genominen DNA valmistetaan suolistonäytteistä ja 16S rRNA-geeneistä, jotka on monistettu PCR:llä aiemmin kuvatulla tavalla. Paripään, multipleksoitu sekvensointi suoritetaan. Yhdellä ajolla tuotetaan 10-20 miljoonaa DNA-sekvenssiä ja 100 000 rRNA-lukemaa näytettä kohti, jotta varmistetaan >99 %:n sekvenssipeitto. Demultipleksointi, laatusuodatus, kimeerien poisto ja sekvenssiluokittelu (SINA/Silvaa käyttäen) seuraavat aikaisempia julkaisuja. Samanlaiset sekvenssit on ryhmitelty taksonomian perusteella operatiivisiin taksonomisiin yksiköihin (OTU).

Mikrobiomitietojen analyysi Päätulos on mikrobiryhmien suhteellinen runsausprosentti (PRA), ja oletamme, että tämä vaihtelee PPI-käyttäjien ja ei-happolääkkeiden käyttäjien välillä. Tietyt mikrobiryhmät (lajit/sukut/fyla), jotka eroavat koeryhmien välillä, tunnistetaan käyttämällä ei-parametrista kaksiosaista tilastoa.40 Tilastolliset analyysit arvioidaan arvolla = 0,05 ja p-arvot korjataan väärien havaitsemisprosenttien (FDR) suhteen.41 Tulokset validoidaan lajikohtaisella QPCR:llä.

Tavoite 2: Määrittää, muuttaako PPI:n käyttö fermentaatiosykliin omistetun suolistobakteeri-RNA:n suhteellista määrää NW- ja OB-yksilöillä. Suoritamme haulikkosekvensoinnin suoliston mikrobiomeista valmistetulle bulkki-RNA:lle tunnistaaksemme mikrobien metaboliareittejä, jotka ilmentyvät eri tavalla PPI-potilailla. Ulosteen aspiraatiot terminaalisesta sykkyräsuolesta, umpisuolesta ja sigmoidisesta paksusuolesta saadaan edellä kuvatulla tavalla.

RNA:n eristäminen ja sekvensointi Mikrobi-RNA uutetaan 50 mg:sta ulosteen aspiraatteja käyttämällä RiboPure Bacteria -uuttopakkausta (Life Technologies Inc., USA). Tätä pilottia varten analysoimme näytteitä yhteensä 48 koehenkilöstä, jotka on jaettu tasan neljään ryhmään: OB/PPI, OB/ei-PPI, NW/PPI ja NW/ei-PPI. Isäntä- ja mikrobi-rRNA poistetaan käyttämällä Ribo-Zero-bakteeri- ja Ribo-Zero-hiiripakkauksia (Epicenre, Inc, USA). RNA-näytteet valmistetaan sekvensointia varten käyttämällä ScriptSeq v2 RNA-Seq (bakteeri) -pakkauksia (Epicentre, Inc, USA). Sekvensointi suoritetaan Illumina HiSeq2000 -alustalla (UC-Denver Microarray ja Genomics Core), joka tarjoaa korkean kattavuuden. Toistettavuuden laadun varmistamiseksi kustakin näytteestä yhdistetään ja sekvensoidaan kaksi mRNA-näytettä. Tässä pilottikokeessa luomme noin 20 x 106 yhden pään 150 emäksen lukua näytettä kohti kullekin mikrobien metatranskriptiotietojoukolle.

Metatranskriptitietojen analyysi Bakteeritranskriptien huomautukset ja luettelointi suoritetaan peptiditasolla käyttämällä BLASTX-hakuja GenBankin noin 1800 bakteerigenomisekvenssiä vastaan ​​sekä NCBI:n ei-redundanttiproteiinitietokantaa käyttäen E-arvon rajaa <10 5.44 Laajat toiminnalliset erot näytteiden välillä arvioidaan käyttämällä COG-,47 KEGG48- ja RAST/SEED-työkaluilla luotuja huomautuksia.49, 50 Enteeristen mikrobien transkriptomien tilastollinen analyysi keskittyy sellaisten metabolisten reittien tunnistamiseen, jotka ilmenevät eri tavalla ryhmien välillä.44 Geenejä, joissa on korkealaatuisia annotaatioita (E<10-5), käytetään NxM geenimatriisin (M) rakentamiseen koehenkilöillä (N), jotka tallentavat tietylle geenille ja kohteelle merkittyjen sekvenssien lukujen lukumäärän. Samanlainen NxM-matriisi geenikategorioista (M) koehenkilöiden (N) mukaan konstruoidaan funktionaalisille luokille osoitettujen sekvenssilukemien jakautumisen taulukoimiseksi. Geenit tai geeniluokat, joiden esiintyvyys tai runsaus vaihtelee hoitoryhmien välillä, tunnistetaan Fisherin eksaktitestillä tai Kruskal-Wallis-testillä, joita sovelletaan matriisin jokaiseen geeniin/luokkaan. Merkittävyys arvioidaan arvolla = 0,05, sen jälkeen kun FDR.41-arvoja on korjattu. P-arvoja käytetään kandidaattigeeniluettelon priorisoimiseen seurantaa varten QPCR:llä geeniekspression seulomiseksi koko potilaskohortissa.

Tavoite 3: Selvittää, missä määrin PPI:n käyttö muuttaa GPR41:n, GPR43:n ja niiden efektorigeenien ilmentymistä NW- ja OB-potilaiden paksusuolessa ja terminaalisessa sykkyräsuolessa. Biopsianäytteet altistetaan paneelille RT-QPCR-määrityksiä mikrobien SCFA-tuotannon vaikuttamien kohdegeenien ilmentymisen seuraamiseksi. Biopsiat terminaalisesta sykkyräsuolesta, umpisuolesta ja sigmoidisesta paksusuolesta otetaan edellä kuvatulla tavalla.

Kvantitatiivinen käänteistranskriptaasi-PCR (qRT-PCR) -analyysi Kokonais-RNA uutetaan käyttämällä RNeasy Mini Kit (Qiagen) ja ISOGEN (WAKO) avulla. Komplementaariset DNA:t transkriptoidaan käyttämällä RNA:ita templaatteina Moloney-hiiren leukemiaviruksen käänteiskopioijaentsyymin (Invitrogen) kanssa. cDNA:t monistetaan PCR:llä Taq DNA-polymeraasilla (TaKaRa) käyttäen sopivia alukkeita. qRT-PCR-analyysit suoritetaan DNA Engine Opticon-2:lla (MJ Research). Lauseke kvantifioidaan kahtena kappaleena.

Näytteen koko ja tehoanalyysi:

Otamme mukaan 24 NW ja 24 lihavia (OB) osallistujia. Puolet NW- ja OB-ryhmistä on PPI-käyttäjiä ja puolet ei käytä happoa vähentäviä lääkkeitä. Tavoitteen 1 ensisijainen tulos on ero Firmicutes- ja Bacteroidetes-bakteerien PRA:ssa. Käytetään kaksisuuntaista ANOVAa (BMI-kategorian ja PPI-käytön tekijät). Alustavien tietojemme perusteella meillä on 94 % teho havaita erot Firmicutien PRA:ssa (72 % vs 52 %, kun SD on 20 %) ja 95 % teho havaita erot Bacteroidetesin PRA:ssa (16 % vs 5 % ja SD 5 % PPI-käyttäjien ja ei-käyttäjien välillä. Tavoitteen 2 ensisijainen tulos on ero fermentaatiosyklille omistetussa bakteeri-RNA:ssa, kun taas tavoitteen 3 tulos on ero GPR 41:n ja GPR 43:n ilmentymisessä. Suoliston mikrobiotaprofiilin ja myöhemmän SCFA-tuotannon odotettujen erojen perusteella odotamme 25 %:n eron PPI-käyttäjien ja ei-käyttäjien välillä molemmissa tuloksissa, mikä antaa meille 99 % tehon sekä tavoitteessa 2 että 3). Teemme myös alaryhmäanalyysit NW- ja OB-ryhmissä.