O efeito da terapia com IBP no peso, microbioma intestinal e expressão de GPR41 e GPR43

Plano de pesquisa:

Os pacientes sem sintomas gastrointestinais agendados para triagem ou colonoscopia de vigilância (para câncer colorretal) no laboratório de endoscopia da UCH serão selecionados para o estudo com base nos critérios de inclusão e exclusão. Os pacientes elegíveis que consentirem no estudo terão altura, peso e informações demográficas medidas e registradas. Eles preencherão um questionário de histórico de peso/dieta. Os pacientes serão submetidos à colonoscopia de triagem/vigilância de acordo com os cuidados clínicos de rotina. As fezes residuais são normalmente aspiradas através do colonoscópio para garantir a visualização completa da mucosa para melhorar a detecção de pólipos. Faremos aspirados de fezes de três locais separados: cólon sigmóide, ceco e íleo terminal. Evidências sugerem que uma preparação intestinal (antes da colonoscopia) não altera significativamente a composição da microbiota intestinal para a maioria dos indivíduos. Também faremos quatro pequenas biópsias em cada um desses três locais. Aspirados de fezes e espécimes de biópsia serão congelados em N2 líquido e congelados a -80C até serem necessários para seus ensaios.

Inscreveremos um total de 48 indivíduos divididos igualmente entre quatro grupos: OB/PPI, OB/não-PPI, NW/PPI e NW/não-PPI. Aproximadamente 40 a 50 pacientes por semana que atendem aos critérios de inclusão/exclusão acima são submetidos a uma colonoscopia de triagem/vigilância na UCH, tornando realista o recrutamento de 2 a 3 pacientes/semana durante 6 a 9 meses para atingir a inscrição desejada.

Objetivo 1: Examinar os efeitos do uso de IBP na microbiota intestinal no cólon e íleo terminal de pacientes com peso normal (NW) e obesos (OB). Os microbiomas intestinais serão perfilados por sequenciamento de 16S rRNA para identificar alterações associadas a PPI na biodiversidade intestinal.

Recipientes de coleta de amostras estéreis separados serão usados ​​para os aspirados de fezes e biópsias da mucosa do cólon sigmóide, ceco e íleo terminal. Será usado sequenciamento de DNA de alto rendimento para análise de microbioma.

Microbioma 16S rRNA Profiling O DNA genômico da comunidade total será preparado a partir de espécimes intestinais e genes 16S rRNA amplificados por PCR conforme descrito anteriormente. Sequenciação multiplexada e pareada será realizada. 10-20 milhões de sequências de DNA serão geradas em uma única execução e 100.000 leituras de rRNA serão geradas por amostra para garantir uma cobertura de sequência > 99%. Demultiplexação, filtragem de qualidade, remoção de quimeras e classificação de sequências (usando SINA/Silva) seguirão publicações anteriores. Sequências semelhantes são agrupadas em unidades taxonômicas operacionais (OTUs) com base na taxonomia.

Análise de dados do microbioma O resultado principal é a abundância relativa percentual (PRA) de grupos microbianos, e supomos que isso será diferente entre usuários de IBP e não usuários de medicamentos de supressão ácida. Grupos microbianos específicos (espécies/gêneros/filos) que diferem entre os grupos experimentais serão identificados usando uma estatística não paramétrica de duas partes.40 As análises estatísticas serão avaliadas em = 0,05 e os valores de p corrigidos para a taxa de descoberta falsa (FDR).41 Os resultados serão validados por QPCR espécie-específica.

Objetivo 2: determinar se o uso de PPI altera a quantidade relativa de RNA bacteriano intestinal dedicado ao ciclo de fermentação em indivíduos NW e OB. Faremos o sequenciamento shotgun de RNA a granel preparado a partir de microbiomas intestinais para identificar vias metabólicas microbianas expressas diferencialmente em pacientes em uso de IBPs. As fezes aspiradas do íleo terminal, ceco e cólon sigmóide serão obtidas conforme detalhado acima.

Isolamento e sequenciamento de RNA O RNA microbiano será extraído de 50 mg de aspirados fecais usando o kit de extração RiboPure Bacteria (Life Technologies Inc., EUA). Para este piloto, analisaremos amostras de um total de 48 indivíduos divididos igualmente entre quatro grupos: OB/PPI, OB/não-PPI, NW/PPI e NW/não-PPI. O rRNA hospedeiro e microbiano será removido usando os kits Ribo-Zero bacteria e Ribo-Zero mouse (Epicentre, Inc, EUA). As amostras de RNA serão preparadas para sequenciamento usando os kits ScriptSeq v2 RNA-Seq (bactérias) (Epicentre, Inc, EUA). O sequenciamento será realizado em uma plataforma Illumina HiSeq2000 (UC-Denver Microarray e Genomics Core), que fornece alta profundidade de cobertura. Para garantir a qualidade da reprodutibilidade, duas amostras de mRNA de cada espécime serão reunidas e sequenciadas. Neste experimento piloto, geraremos ~ 20x106 leituras de 150 bases de ponta única por amostra para cada conjunto de dados de metatranscriptoma microbiano.

Análise de dados de metatranscriptoma A anotação e a enumeração de transcritos bacterianos serão realizadas no nível do peptídeo usando pesquisas BLASTX contra as aproximadamente 1800 sequências do genoma bacteriano atualmente disponíveis no GenBank, bem como o banco de dados de proteínas não redundantes do NCBI usando um corte de valor E de <10- 5.44 Diferenças funcionais de nível amplo entre as amostras serão avaliadas usando anotações geradas por meio das ferramentas COG,47 KEGG48 e RAST/SEED.49, 50 A análise estatística dos transcriptomas microbianos entéricos se concentrará na identificação de vias metabólicas que são expressas diferencialmente entre os grupos.44 Genes com anotações de alta qualidade (E<10-5) serão usados ​​para construir uma matriz NxM de genes (M) por indivíduos (N) registrando o número de leituras de sequência anotadas para um determinado gene e indivíduo. Uma matriz NxM semelhante de categorias de genes (M) por indivíduos (N) será construída para tabular a distribuição de leituras de sequência atribuídas a categorias funcionais. Genes ou categorias de genes que diferem em prevalência ou abundância entre os grupos de tratamento serão identificados pelo teste exato de Fisher ou teste de Kruskal-Wallis, respectivamente, aplicados a cada gene/categoria na matriz. A significância será avaliada em = 0,05, após a correção para FDR.41 Os valores P serão usados ​​para priorizar uma lista de genes candidatos para validação de acompanhamento usando QPCR para rastrear a expressão gênica em toda a coorte de pacientes.

Objetivo 3: Determinar até que ponto o uso de IBP altera a expressão de GPR41, GPR43 e seus genes efetores no cólon e íleo terminal de pacientes NW e OB. As amostras de biópsia serão submetidas a um painel de ensaios RT-QPCR para monitorar a expressão de genes-alvo impactados pela produção microbiana de SCFA. As biópsias do íleo terminal, ceco e cólon sigmóide serão obtidas conforme detalhado acima.

Análise quantitativa da transcriptase reversa-PCR (qRT-PCR) O RNA total será extraído usando o RNeasy Mini Kit (Qiagen) e ISOGEN (WAKO). Os DNAs complementares serão transcritos usando RNAs como moldes com a transcriptase reversa do vírus da leucemia murina de Moloney (Invitrogen). Os cDNAs serão amplificados por PCR com Taq DNA polimerase (TaKaRa) usando os primers apropriados. As análises qRT-PCR serão realizadas usando o DNA Engine Opticon-2 (MJ Research). A expressão será quantificada em duplicata.

Tamanho da amostra e análise de poder:

Vamos inscrever 24 participantes NW e 24 obesos (OB). Metade dos grupos NW e OB serão usuários de IBP e metade não serão usuários de medicamentos supressores de ácido. O resultado primário para o Objetivo 1 é a diferença no PRA de Firmicutes e Bacteroidetes. Uma ANOVA de duas vias (fatores de categoria de IMC e uso de PPI) será usada. Com base em nossos dados preliminares, teremos 94% de poder para detectar uma diferença no PRA de Firmicutes (72% vs 52% com SD de 20%) e 95% de poder para detectar diferenças no PRA de Bacteroidetes (16% vs 5 % com DP de 5%) entre usuárias e não usuárias de PPI. O resultado primário para o objetivo 2 é a diferença no RNA bacteriano dedicado ao ciclo de fermentação, enquanto o resultado para o objetivo 3 é a diferença na expressão de GPR 41 e GPR 43. Com base nas diferenças esperadas no perfil da microbiota intestinal e na subsequente produção de SCFA, esperamos uma diferença de 25% entre usuários e não usuários de IBP para ambos os resultados, dando-nos 99% de poder para os Objetivos 2 e 3). Também realizaremos análises de subgrupos dentro dos grupos NW e OB.